健身運(yùn)動時人體體溫變化的檢測試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測，具體涉及人體健身運(yùn)動時體溫變化基因檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 體溫是肌體進(jìn)行新陳代謝和正常生命活動的必要條件。體溫又受多種因素影響， 如肌肉活動，精神緊張及環(huán)境溫度的變化。人體處于安靜狀態(tài)時，肝、腸和腎等內(nèi)臟器官的 產(chǎn)熱在機(jī)體總熱量的50%左右，呼吸、循環(huán)及腦的產(chǎn)熱量占30%，人體骨骼肌產(chǎn)熱量只占 20%左右；但處在運(yùn)動狀態(tài)時骨骼肌成為最主要的產(chǎn)熱器官，占總熱量的90%。傳統(tǒng)觀點(diǎn) 認(rèn)為由于運(yùn)動中代謝水平提高，人體產(chǎn)熱增加，盡管經(jīng)機(jī)體調(diào)節(jié)加強(qiáng)了散熱過程，但仍不能 保證體溫平衡而使體溫升高。體溫升高越大，體力下降越快，同時也造成強(qiáng)烈的不舒適感， 影響運(yùn)動能力 不同的個體運(yùn)動時體溫變化程度不同，主要是由于基因的差異造成的。因此，無論對于 普通的人群進(jìn)行健身運(yùn)動，還是對于專業(yè)體育運(yùn)動員進(jìn)行選拔和訓(xùn)練，體溫變化程度都是 一項重要的衡量指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種體溫變化基因檢測試劑盒，該試劑盒對受測者的相 關(guān)基因進(jìn)行檢測，分析得到其運(yùn)動時的體溫變化程度，且PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一臺PCR儀上同 步進(jìn)行并具備檢測的高效性、特異性。
[0004] 一種體溫變化基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，存放的試劑 包括： (1) 針對2個基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組： 針對SNP rs2360969的引物組： 5, -gtATTTCAACAAGTCTTGCC-3^ 5' -GCATCGGAATCACCA-3' 5' -AGCAATGGGTCTCAAAATG-3, 5' -GAAGCAGGAGGAGTC-3, 針對SNP rs2253206的引物組： 5' -GATAAGTTACAGTTAA-3, 5' -CCCATTCCTCCTACC-3' 5> -GACCACTCAGAAATTCAC-3> 5' -TCTCTCCAGCCTCTCC-3' (2) PCR擴(kuò)增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
[0005] 本發(fā)明提供的體溫變化基因檢測試劑盒的有益效果是；通過PCR引物的設(shè)計使多 個PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一臺PCR儀上同步進(jìn)行，對受測者的相關(guān)基因進(jìn)行檢測，并實現(xiàn)檢測的 高效性、特異性，分析體溫變化程度，從而指導(dǎo)受測者在健身運(yùn)動時應(yīng)當(dāng)采取的方案，避免 對其無效甚至是有害的方法。同時為專業(yè)運(yùn)動員的選材和訓(xùn)練提供科學(xué)依據(jù)。
【附圖說明】
[0006] 圖1是反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0007] 體溫變化基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，存放的試劑包 括： (1)針對2個基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組： 針對SNP rs2360969的引物組： 5, -gtATTTCAACAAGTCTTGCC-3^ 5' -GCATCGGAATCACCA-3' 5' -AGCAATGGGTCTCAAAATG-3, 5' -GAAGCAGGAGGAGTC-3, 針對SNP rs2253206的引物組： 5' -GATAAGTTACAGTTAA-3, 5' -CCCATTCCTCCTACC-3' 5> -GACCACTCAGAAATTCAC-3> 5' -TCTCTCCAGCCTCTCC-3' 2) PCR擴(kuò)增試劑； (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
[0008] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的方法予W進(jìn)一步的說明。
[0009] 本實施例對測試者采用體溫變化基因檢測試劑盒同時檢測2個基因的SNP多態(tài) 位點(diǎn)，并根據(jù)基因分型結(jié)果，分析體溫變化程度，從而指導(dǎo)受測者在健身運(yùn)動時應(yīng)當(dāng)采取的 方案，避免對其無效甚至是有害的方法。同時為專業(yè)運(yùn)動員的選材和訓(xùn)練提供科學(xué)依據(jù)。
[0010] 使用到的體溫變化基因檢測試劑盒內(nèi)試劑由W下組成： (1) 針對2個基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組： 針對SNP rs2360969的引物組： 5, -gtATTTCAACAAGTCTTGCC-3^ 5' -GCATCGGAATCACCA-3' 5' -AGCAATGGGTCTCAAAATG-3, 5' -GAAGCAGGAGGAGTC-3, 針對SNP rs2253206的引物組： 5' -GATAAGTTACAGTTAA-3, 5' -CCCATTCCTCCTACC-3' 5> -GACCACTCAGAAATTCAC-3> 5' -TCTCTCCAGCCTCTCC-3' (2) PCR擴(kuò)增試劑；10XPCR緩沖液，該P(yáng)CR緩沖液為100mMTris-肥lp冊.3,500mM KCl，15mM MgC12 ;dNTPs混合物，該dNTPs混合物為Η磯酸鳥嘿嶺脫氧核巧酸dGTP，Η磯 酸腺嘿嶺脫氧核巧酸dATP，Η磯酸胸腺嚼巧脫氧核巧酸dTTP，Η磯酸胞嚼巧脫氧核巧酸 dCTP四種核巧酸，各組分濃度為2. 5mM ;5υ/μ 1熱啟動Taq酶。
[0011] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑諒脂糖、TAE緩沖液、DM分子量標(biāo)準(zhǔn)、Goldview 染色液和DM上樣緩沖液，該緩沖液W漠酪藍(lán)為指示劑稀釋至IX后使用。
[0012] 使用上述體溫變化基因檢測試劑盒按如下步驟進(jìn)行檢測： (1)提取樣本基因組DNA。
[0013] 采集該測試者唾液，向l-2ml唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，該DNA提取 緩沖溶液溶劑為50mM的化is-肥1 pH7. 4、0. 5mM的邸TA和50mM的化C1，反復(fù)吹打混勻 后，SOOOXg離必5分鐘，棄去上清，此步驟重復(fù)一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液， 該裂解液溶劑為 50mM Tris-肥 1 pH7. 4,50mM Tris-肥 1 pH7. 4，150mM 化Cl，lmM 邸TA，1% Triton x-100，l% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS,蛋白酶 K20mg/mL,徹底懸浮沉淀并 充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離必管數(shù)次；得到的混合液中，加入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置lOmin ;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯 仿混合溶液，苯酪和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000Xg離必5分鐘，上清 液移入干凈離必管內(nèi)；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干凈離必管內(nèi)；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干 凈離必管內(nèi)；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-2(TC靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離必10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5血70 %己醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離必5分鐘，棄上清液，此步驟重復(fù)一次；得到的沉淀物自然風(fēng) 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-2(TC保存。
[0014] (2)PCR 擴(kuò)增 本實施例同時檢測rs2360969和rs2253206。每個SNP的檢測需要一對上下游引物、兩 條多態(tài)引物共4條PCR引物，共需要8條引物。每個SNP的檢測需要做兩管PCR擴(kuò)增，為防 止出現(xiàn)假陽性之類的反應(yīng)，衡量PCR是否成功，加設(shè)一管陰性對照組，共做5管PCR，所述 陰性對照組基因組模板及反應(yīng)體系是一樣的，但沒有引物存在。
[001引根據(jù)不同的檢測位點(diǎn)，用相應(yīng)的引物按如下比例分別配制PCR反應(yīng)體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0016] 將裝有反應(yīng)溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件如下： 預(yù)變性951：3111111;熱循環(huán)941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3,35個循環(huán)；延伸721：3111111。反應(yīng) 結(jié)束后，取出試管。
[0017] 由于5管PCR擴(kuò)增反應(yīng)是在同一臺PCR儀上同步進(jìn)行的，為了實現(xiàn)檢測的高 效性、特異性，要求8條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進(jìn)行大量的DNA序列軟件分析來 設(shè)計PCR引物，并通過大量的實驗來進(jìn)行Tm值的優(yōu)化并確定設(shè)計的合理性，本試劑盒各基 因 SNP多態(tài)性的檢測是既相對獨(dú)立又相互聯(lián)系的，不可分割。
[001引（3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產(chǎn) 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結(jié)果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0019] 檢測得到2個基因分型分析結(jié)果如下：
根據(jù)W上分型結(jié)果，該測試者在運(yùn)動時體溫變化較小。意味著在較大和較長時間的運(yùn) 動時，體溫波動幅度小，不舒適感不強(qiáng)烈。該測試者適合耐力運(yùn)動項目，具有較強(qiáng)的運(yùn)動愉 悅感。如果是專業(yè)運(yùn)動員，可W在訓(xùn)練時加大強(qiáng)度，不會導(dǎo)致很強(qiáng)烈的痛苦感。
[0020] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 體溫變化基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，其特征在于：存放 的試劑包括： (1) 針對2個基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組： 針對SNP rs2360969的引物組： 5' -GTATTTCAACAAGTCTTGCC-3' 5, -GCATCGGAATCACCA-3' 5' -AGCAATGGGTCTCAAAATG-3， 5, -GAAGCAGGAGGAGTC-3， 針對SNP rs2253206的引物組： 5, -GATAAGTTACAGTTAA-3， 5' -CCCATTCCTCCTACC-3' 5' -GACCACTCAGAAATTCAC-3' 5' -TCTCTCCAGCCTCTCC-3' (2) PCR擴(kuò)增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0· 5_1· Ο u 1 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增試劑 包括：10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包 含：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增試 劑用量為：10 XPCR緩沖液2. 5 μ 1，dNTPs2 μ 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2 μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電 泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA無毒染料和DNA上樣緩沖 液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒染料 優(yōu)選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體溫變化基因檢測試劑盒，其特征在于：為受測者提供在運(yùn) 動時體溫變化幅度的檢測，變化幅度小則適合較大強(qiáng)度和較長時間的運(yùn)動，運(yùn)動愉悅感較 強(qiáng)，反之，則不適合強(qiáng)度大，時間長的運(yùn)動，運(yùn)動時較易感到痛苦。
【專利摘要】本發(fā)明提供了人體健身運(yùn)動時體溫變化的基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，試劑包括：（1）針對2個基因SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組（2）PCR擴(kuò)增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發(fā)明通過PCR引物的設(shè)計使多個PCR擴(kuò)增反應(yīng)可在同一臺PCR儀上同步進(jìn)行，對受測者的相關(guān)基因進(jìn)行檢測，并實現(xiàn)檢測的高效性、特異性，分析得到其體溫變化的遺傳因素，從而為受測者獲得一個合適的健康方案，了解自身的運(yùn)動強(qiáng)度和舒適度，在健身運(yùn)動中采取相應(yīng)的策略避免對其無效甚至是有害的方法。同時為專業(yè)運(yùn)動員的選材和訓(xùn)練提供科學(xué)依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105586396
【申請?zhí)枴緾N201410651964
【發(fā)明人】李則軒, 范家成, 盧駿, 張舒, 邱嘉銘, 別茜, 張靜靜, 朱軼凡
【申請人】武漢白原科技有限公司, 湖北省體育科學(xué)研究所
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2014年11月17日