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一種馬鈴薯轉基因成分的檢測方法

文檔序號:9823119閱讀:638來源:國知局
一種馬鈴薯轉基因成分的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物檢測領域,特別設及一種馬鈴馨轉基因成分的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 馬鈴馨是我國主要作物,馬鈴馨的轉基因技術已成熟,需要對轉基因馬鈴馨的推 廣進行監(jiān)管,轉基因成分檢測是轉基因監(jiān)管的技術支撐。
[0003] 現(xiàn)有的轉基因成分檢測技術主要檢測核酸或蛋白質(zhì),其中,基于核酸的檢測方法 主要流程為:提取待測樣品中的核酸,利用PCR^olymerase化ainReaction,聚合酶鏈反應) 的方法擴增樣品中的轉基因成分,利用實時定量、瓊脂糖電泳或忍片技術檢測轉基因成分 是否存在。
[0004] 在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術至少存在W下問題中的一種:
[0005] 轉基因成分多種多樣,而現(xiàn)有技術一次只能檢測其中一種或少數(shù)幾種,因此,需要 對可能的多種轉基因成份逐一進行檢測,才能確定為"非轉基因"產(chǎn)品;一般檢測的是共轉 化的轉基因成分,而不是外源基因本身,因此,對于無標記轉基因來說,采用現(xiàn)有的檢測方 法進行檢測會失效;檢測基本上是定性檢測,但定量檢測又有其現(xiàn)實需求,例如,少量轉基 因馬鈴馨品種混入非轉基因品種中,在定性檢測時,非轉基因品種將被誤判為轉基因品種, 可能產(chǎn)生錯誤的法院判決或行政處罰。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術的問題,本發(fā)明實施例提供了一種馬鈴馨轉基因成分的檢測方 法。所述技術方案如下:
[0007] 本發(fā)明實施例提供了一種馬鈴馨轉基因成分的檢測方法,所述方法包括:
[000引確定待測樣品中需要檢測的轉基因成分、所述待測樣品中的內(nèi)源標準基因和所述 待測樣品的外源標準基因,所述待測樣品為馬鈴馨植株或馬鈴馨植株的一部分;
[0009] 制備用于擴增所述轉基因成分、所述內(nèi)源標準基因和所述外源標準基因的測試區(qū) 域的多重擴增引物;
[0010] 對所述待測樣品進行抽樣并混合,得到混合樣品;
[0011] 提取所述混合樣品的基因組;
[0012] 向所述混合樣品的基因組中加入所述外源標準基因,得到混合核酸;
[0013] 利用所述多重擴增引物對所述混合核酸進行擴增,得到擴增產(chǎn)物,利用所述擴增 產(chǎn)物構建高通量測序文庫;
[0014] 對所述高通量測序文庫進行高通量測序,得到測序片段組;
[0015] 分析所述測序片段組,獲得所述待測樣品中所述轉基因成分的測序片段的數(shù)量、 所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù)量和所述外源標準基因的測序片段的數(shù)量;
[0016] 根據(jù)所述外源標準基因的測序片段的數(shù)量,判斷實驗是否成功;
[0017] 若所述實驗成功,則計算所述待測樣品種中所述轉基因成分的含量;
[0018] 根據(jù)所述轉基因成分的含量判斷所述待測樣品中是否含有轉基因成分。
[0019] 具體地,所述轉基因成分為外源功能基因、抗性標記基因、啟動子、終止子和外源 插入旁側序列中的至少一種。
[0020] 具體地,所述內(nèi)源標準基因為所述待測樣品的基因組中的單拷貝基因。
[0021 ]具體地,所述外源標準基因不存在于所有生物中。
[0022] 具體地,所述判斷實驗是否成功的方法為:當所述外源標準基因的測序片段的數(shù) 量和所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù)量均含α1時,則實驗成功;當所述外源標準基因的 測序片段的數(shù)量或所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù)量<α1時,則實驗失敗;其中,α1為判 定闊值。
[0023] 具體地,所述判定所述待測樣品是否含有轉基因成分的方法為:當需要檢測的任 意一種所述轉基因成分的含量含02時,判定所述待測樣品含有轉基因成分;當所有所述轉 基因成分的含量如2時,判定所述待測樣品不含有轉基因成分;其中,α2為判定闊值。
[0024] 具體地,計算所述待測樣品種中所述轉基因成分的含量的方法為:第m種所述轉基 因成分的含量的計算公式為
其中,i為所述第m種轉基因成分的 第i個測試區(qū)域,nl為所述第m種轉基因成分的所述測試區(qū)域的個數(shù),bi為所述第m種轉基因 成分的第i個所述測試區(qū)域的所述測序片段的數(shù)量,k為第k種所述內(nèi)源標準基因,n3為所述 內(nèi)源標準基因的個數(shù),j為第k種所述內(nèi)源標準基因的第j個測試區(qū)域,n2為所述第k種內(nèi)源 標準基因的所述測試區(qū)域的個數(shù),aj為所述第k種內(nèi)源標準基因的第巧巾所述測試區(qū)域的所 述測序片段的數(shù)量;N為所有所述內(nèi)源標準基因的所述測試區(qū)域的總數(shù)。
[0025] 具體地,所述外源標準基因的質(zhì)量與所述混合樣品的基因組的總質(zhì)量的比例大于 1/100000。
[0026] 本發(fā)明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是:本發(fā)明提供的檢測方法可W在 不同待測樣品、不同檢測的目標基因間通用,可W-次性檢測任意多種需要檢測的轉基因 成分,從而判定待測樣品是否含有轉基因成分,該方法可W實現(xiàn)定量檢測,且檢測結果幾乎 沒有下限,結果準確可靠,是現(xiàn)有技術達不到的。
【具體實施方式】
[0027] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚,下面將對本發(fā)明實施方式作進一 步地詳細描述。本發(fā)明實施例中未注明或詳細描述的操作流程或操作規(guī)范均為普通分子生 物學技術人員所熟知的操作。本發(fā)明實施例中未注明的試劑或生物材料均為市場上銷售的 常用試劑或生物材料,均為普通分子生物學技術人員所熟知的,且可W在市場上購買到。 [002引實施例
[00巧]通過農(nóng)桿菌介導法將雙丙氨酷憐抗性(Biolaphos resistance,Ba;r)基因?qū)胩?馨9號馬鈴馨品種,自交純化3代后,獲得改造的天馨9號馬鈴馨品種,作為本實施例的待測 馬鈴馨品種。其中,天馨9號馬鈴馨是轉基因馬鈴馨受體品種,由天水市農(nóng)業(yè)科學研究所中 梁試驗站育成,本實施例中使用的天馨9號馬鈴馨塊莖由江漢大學保存和繁殖。
[0030]馬鈴馨轉基因成分檢測方法,具體步驟如下:
[0031] 步驟1、確定待測樣品中需要檢測的轉基因成分、待測樣品中的內(nèi)源標準基因和待 測樣品的外源標準基因,具體方法如下:待測樣品為馬鈴馨植株或馬鈴馨植株的一部分,其 中,馬鈴馨植株可W為馬鈴馨植株的根、莖、葉、花、果實或種子等器官,也可W是巧巾及巧中 W上的不同器官的混合物,如葉和莖的混合物,馬鈴馨植株的一部分可W為馬鈴馨植株的 根、莖、葉、花、果實和種子等至少一個器官中的一部分。在本實施例中,待測樣品為改造后 的天馨9號馬鈴馨的葉片,轉基因成分、內(nèi)源標準基因和外源標準基因均含1個,轉基因成分 可W為外源功能基因、抗性標記基因、啟動子、終止子和外源插入旁側序列中的至少一種, 即通過轉基因技術手段向天馨9號馬鈴馨品種中轉入不存在于天馨9號馬鈴馨品種中的外 源核酸序列;內(nèi)源標準基因為待測樣品的基因組中的單拷貝基因。在本實施例中,內(nèi)源標準 基因通過NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih. gov/)在待測樣品基因組上比對時為單一序列; 外源標準基因不存在于所有生物中,在本實施例中,所使用的外源標準基因為邸CC04基因, 其在NCBI上同源比對時,未發(fā)現(xiàn)同源序列,可W判定外源標準基因不存在于所有生物中。在 本實施例中,檢測的轉基因成分共5種,內(nèi)源標準基因1種,外源標準基因1種,其相關信息見 表1,表1中所列轉基因成分不僅包括Bar基因,其為外源功能基因,還包括其他轉基因成分, 運些轉基因成分在轉基因作物中廣泛使用,因此,本實施例提供的檢測方法具有通用性。表 1中的基因序列有兩種表示方式,一種是直接寫出基因序列,另一種是NBCI的基因編號,表1 中的測序區(qū)域中的數(shù)字代表堿基的位置,該基因的第1個堿基的位置定義為1。
[0032] 表1為實施例一中被檢測基因的相關信息與檢測結果
[0033]
[0034]
[0035] 表1中'7'表示無。
[0036] 步驟2、制備用于擴增轉基因成分、內(nèi)源標準基因和外源標準基因的多重擴增引 物,具體方法如下:
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