檢測人類brca1和brca2基因突變的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及檢測人類BRCA1和BRCA2基因突變的引物、試 劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌和卵巢癌是女性常見惡性腫瘤，一般人群中女性在其一生中罹患乳腺癌和 卵巢癌的風(fēng)險分別為13%和1.5%，我國近年來乳腺癌發(fā)病率高居女性惡性腫瘤的首位，并 上的速度逐年遞增（Antoniou A,Pha;ro址 PD,化rod S,et al.Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCAl or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies.American Journal of Human Genetics 2003;72(5):1117-1130)。目前認(rèn)為大多 數(shù)遺傳性乳腺癌是由于基因突變引起的，其中BRCAl和BRCA2基因的突變與乳腺癌發(fā)病關(guān)系 較為密切。有研究表明，攜帶BRCA1或BRCA2基因致病性突變的女性在其70歲后患病風(fēng)險增 加了5-30倍，分別高達(dá)75%和46%(Cao W,Wang X,Li JC.Heredi1:a;ry breast cancer in the Han Chinese population.J Epidemiol.2013;23:75-84)。
[0003] BRCAl基因定位于人類染色體17ql2-21，全長8化，含24個外顯子，編碼蛋白含有 1863個氨基酸殘基。BRCA2基因定位于13ql2.3,由27個外顯子組成，編碼蛋白含有3418個氨 基酸殘基。BRCAl和BRCA2基因都是腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期的調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、 DNA損傷的修復(fù)及調(diào)亡等重要的細(xì)胞活動。一旦BRCAl或BRCA2基因發(fā)生致病性突變，致使其 無法正常編碼合成蛋白產(chǎn)物或合成的蛋白產(chǎn)物功能缺失，其抑癌作用將會受到影響，增加 癌癥發(fā)生發(fā)展的危險。
[0004] 2014版NCCN乳腺癌臨床指南建議:BRCAl/2基因突變的遺傳性乳腺癌高風(fēng)險人群 應(yīng)采取必要的預(yù)防和監(jiān)控措施，對于BRCA1/2基因突變陽性的患者需考慮對側(cè)癌變的高風(fēng) 險(NCCN Clinical Practice Guidelines version 1 2014 for breast cancer)。若對于 乳腺癌/卵巢癌患者，攜帶BRCAl/2基因致病性突變會使多發(fā)病灶和對側(cè)癌變的風(fēng)險增加。 2014年12月，美國FDA批準(zhǔn)抗癌新藥Olapar化化y噸arza)用于治療BRCAl或BRCA2基因突變 的卵巢癌患者。近期臨床研究表明，生殖系BRCAl或BRCA2突變的多種腫瘤可W從Olapar化 治療中得到緩解化 aufman B,化 apira-Frommer R,Schmutzler RK,et al:01apa;rib monotherapy in patients with advanced cancer and a germline BRCAl/2 mutation.J Clin Oncol 33:244-50,2015)。通過對服CAl和BRCA2基因突變的檢測，可W預(yù) 測乳腺癌或卵巢癌發(fā)生發(fā)展，也可W篩選出乳腺癌、卵巢癌及其他相關(guān)惡性腫瘤的高危人 群，針對卵巢癌患者，更可W從抗癌新藥Olaparib中獲益。
[000引目前，檢測BRCA1/2基因突變的方法有很多，主要有：巧光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)靈 敏度高、特異性強(qiáng)，但每次只能檢測一種類型的突變，無法完全覆蓋BRCA巧郵RCA2基因全編 碼區(qū)；限制小片段長度多態(tài)性分析法(RFLP法），用于檢測酶切位點(diǎn)改變的基因，可直接判斷 基因型，但是不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因檢測，且實(shí)驗操作繁瑣，檢測周期長，成 本高；Sanger測序法，靠近引物的序列容易測不準(zhǔn)，且測序周期較長，操作復(fù)雜，成本昂貴， 很難滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。因此，急需能夠相對方便、快捷、檢測周期短、針對性強(qiáng)、檢測結(jié) 果準(zhǔn)確可靠的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速、全面準(zhǔn)確、操作簡便、成本低的檢測BRCA1和 BRCA2基因全外顯子及其與內(nèi)含子連接區(qū)和非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)突變的引物。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測BRCA1和BRCA2基因全外顯子及其與內(nèi)含子 連接區(qū)和非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)突變的引物對，其特征在于，所述引物對中的上游引物為上 游特異性引物，同時其5'端加上通用引物化gl;下游引物為下游特異性引物，同時其5'端加 上通用引物化g2;其中上游特異性引物如SEQ ID NO: 1，3，5，7，9-193所示;下游特異性引物 如沈9 10^:2,4,6,8，10-194所示;所述化邑1序列如沈9 10^:195所示，所述化邑2序列如 沈Q ID NO: 196所示。
[0008] 進(jìn)一步，還包括新的引物對，所述新的引物對中的上游引物為帶有P5序列和SEQ 10^:221-236所示序列的上游引物;下游引物為帶有口7序列和569 10^:197-220所示序 列的下游引物。
[0009] 本發(fā)明的另一個方面，提供檢測BRCA1和BRCA2基因全外顯子及其與內(nèi)含子連接區(qū) 和非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)突變的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的引物對。
[0010] 本發(fā)明的另一個方面，提供檢測BRCA1和BRCA2全外顯子及其與內(nèi)含子連接區(qū)和非 翻譯區(qū)和啟動子區(qū)突變的方法，其特征在于，步驟為，
[0011] 文庫制備：
[001引第一步PCR擴(kuò)增：W待檢測樣本DNA作為模板，分為8管分別進(jìn)行擴(kuò)增；引物為上述 所不序列；
[0013] 第二步PCR擴(kuò)增：W第一步PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為模板，引物為上述所示新的引物 對序列；
[0014] 得到的第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理后即為文庫；
[0015] 測序與結(jié)果分析:對文庫進(jìn)行測序，測序的結(jié)果經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后得到檢測基因的 突變情況;數(shù)據(jù)處理為測序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、質(zhì)控、與參考基因組NCBI 137/化19的序列比對、突 變位點(diǎn)分析，通過數(shù)據(jù)處理后得到檢測樣本的突變信息。
[0016] 進(jìn)一步，所述第一步PCR擴(kuò)增的8管引物分別為:第一管的引物是SEQ ID NO: 1-30 所示序列，第二管的引物是SEQ ID NO :31-60所示序列，第Ξ管的引物是SEQ ID NO :61-80 所示序列，第四管的引物是SEQ ID NO:81-110所示序列，第五管的引物是SEQ ID NO: 111- 140所示序列，第六管的引物是SEQ ID NO:141-160所示序列，第屯管的引物是SEQ ID NO: 161-180所示序列，第八管的引物是SEQ ID NO: 181-194所示序列。
[0017] 進(jìn)一步，所述第一步PCR擴(kuò)增的程序是94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性45秒、60°C退火 45秒、68°C延伸2分鐘循環(huán)20次，72°C最后延伸10分鐘。
[0018]進(jìn)一步，所述第二步PCR擴(kuò)增所用的模板進(jìn)行了純化。
[0019] 進(jìn)一步，所述第二步PCR擴(kuò)增的程序是94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性45秒、60°C退火 45秒、68°C延伸2分鐘循環(huán)20次，72°C最后延伸10分鐘。
[0020] 進(jìn)一步，所述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理為在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入21.3化AMPure磁珠進(jìn) 行吸附，體積分?jǐn)?shù)80 %乙醇清洗兩次后，加入30-4化L純化水洗脫。
[0021 ] 本發(fā)明中共包含97對引物，如SEQ ID NO: 1-194所示，將97對引物分在8個管子里 面進(jìn)行擴(kuò)增，每個管子的引物對數(shù)介于1-20對之間，每對引物的濃度介于0.1-25PM之間。其 引物序列具體如表1所示。其中序列編號對應(yīng)相應(yīng)的SEQ ID NO號，即序列編號1對應(yīng)的是 SEQ ID N0:1，W此類推;SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2是一對上下游引物，W此類推。
[0022] 表1 97對引物序列表
[0023]






[0030]本發(fā)明提供的用于檢測BRCAl/2基因突變方法，具體原理詳見圖1和圖2,其中圖1 為第一步PCR擴(kuò)增原理圖，圖2為第二步PCR擴(kuò)增原理圖。其方法包括W下步驟：
[0031 ] 根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)公布的人類BRCA1和BRCA2野生型基因序列，針對BRCA1和BRCA2基 因的全外顯子及其與內(nèi)含子連接區(qū)和非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)設(shè)計特異性引物(SEQ ID N0:1- 194)，并在特異性上游引物的5'端加上通用引物化gl，在特異性下游引物的5'端加上通用 引物化邑2。
[0032] Tagl序列：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 沈Q ID N0:195;
[0033] Tag2序列：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 沈Q ID N0:196。
[0034] (1)提取檢測樣本的