檢測小麥?zhǔn)欠窈写孛?vs染色體臂的成套試劑與分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中檢測小麥遺傳背景中是否含有簇毛麥6VS染色體臂的 成套試劑與分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 簇毛麥D曰sypyrum villosum(L. )P.C曰nd曰rgy(syn.H曰yn曰Idi曰 villos曰 Schur)是 小麥族簇毛麥屬的一個(gè)二倍體種,化=2x= 14。它起源于地中海的東北部,從南歐的法國南 部到里海,西南亞,俄羅斯和高加索地區(qū)(De化ce等1995;化eder化sen 1991),是一種雜草 類植物,生長在惡劣、干旱的環(huán)境中(Agnieszka Gradzielewska,2006)。由于其穎殼脊上和 外釋頂端有叢生的毛狀物,故名之。
[0003] 簇毛麥含有許多生物脅迫和非生物脅迫抗性基因及優(yōu)質(zhì)基因,是改良小麥的優(yōu)良 基因源。Sears、Lukaszewski和劉大均等先后將簇毛麥基因組轉(zhuǎn)移到小麥的遺傳背景,育成 3套染色體附加系。根據(jù)簇毛麥來源的不同,Qi等(1998)首先將Sears培育的小麥-簇毛麥附 加系用DA1V#1-DA7V#1表示,將南京農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的小麥-簇毛麥附加用DA1V#2-DA7V#2表 示,Liu等(2011)隨后將A.J丄ukaszewski培育的附加系用DA1V#3-DA7V#3表示,申請人將前 蘇聯(lián)簇毛麥No. 1026衍生的6VS染色體命名為6V#4S(Lin等,2013)。
[0004] 6V#1 S,6V#2S,6V#3S和6V#4S染色體臂的區(qū)別僅在于來源地不同。6V#1 S,6V#2S, 6V#3S和6V#4S染色體短臂來源不同對小麥白粉病抗性也表現(xiàn)不同。攜帶6V#1S和6V#3S染色 體的小麥不抗白粉病,而具有6V#2S和6V#4S染色體的小麥對白粉病均表現(xiàn)免疫化iu等, 2011)。
[0005] 陳佩度等(1995)利用6V#2(6A)異代換系與揚(yáng)麥5號雜交,結(jié)合雜種后代的丫-射線 處理,成功選育出抗白粉病T6V#2S · 6AL易位系,其抗病基因命名為化21(Qi等,1996)。陳孝 等(1996)利用來自前蘇聯(lián)的簇毛麥No. 1026培育了硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體TH1,TH2和 TH3,及抗白粉病的6V#4(6D)代換系94622-1、94625-1、94632-1和94633-1,利用1'冊與小麥 品種宛7107雜交、回交,未成熟胚培養(yǎng)及/花藥培養(yǎng)等方法,培育出6V#4S · 6化染色體易位 系化97033、化97034和 Rii97035(Li 等,2005)。
[0006] 雖然6V#2S · 6AL易位系和6V#4S · 6化易位系對小麥條紋花葉病毒及其傳媒載體- 小麥卷曲蛾的敏感性不同;在染色體水平上,2條外源染色體臂也與不同的小麥染色體建立 了連鎖關(guān)系,但二者對白粉病菌所有小種表現(xiàn)免疫,故在白粉病抗性表型上難于相互區(qū)分。
[0007] 基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記是一種鑒定外源染色體的簡便手段。目前為止,針對6V# 2S · 6AL易位系開發(fā)的特異PCR標(biāo)記有如下7個(gè)。Qi等通過隨機(jī)引物擴(kuò)增法篩選的RAPD標(biāo)記 0PH17;Liu等將該標(biāo)記的擴(kuò)增片段回收測序后轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記SCARi7〇o;Cao等 (2006)基于一個(gè)受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)的絲/蘇氨酸蛋白激酶基因(Contigl7515)序列開發(fā)了 一個(gè)可同時(shí)擴(kuò)增6VS/6AS/6BS/6DS的共顯性標(biāo)記NAU/xibaol5F和NAU/xibaol5R;畑en (2006)等利用抑制差減雜交獲得一個(gè)在攜帶Pm21的抗病系中特異表達(dá)的富亮氨酸結(jié)構(gòu)域 基因化-LRR2,將其轉(zhuǎn)化為PCR標(biāo)記,可特異擴(kuò)增6VS和6AS;王春梅等(2006)對11個(gè)抗病基因 同源序列(RGA)和17對STS引物進(jìn)行多態(tài)性分析,獲得2個(gè)穩(wěn)定的特異性分子標(biāo)記 CINAU17-1086和CINAU18-723 ,可特異擴(kuò)增6VS染色體臂。上述化0、化en和王春梅等開發(fā)的標(biāo) 記均在聚丙締酷胺凝膠中分離。
[000引對6VMS ·抓L易位系,李輝等(2005)篩選了5個(gè)6VS染色體特異的RAPD分子標(biāo)記, 其中OPAL03750僅能從攜帶6V#4S染色體臂的簇毛麥和小麥中擴(kuò)增,成為區(qū)別于6V#2S · 6AL 的分子標(biāo)記。申請人也開發(fā)了 1個(gè)可特異區(qū)別6V#2S · 6AL和6V#4S ·抓L的分子標(biāo)記(張?jiān)讫?等,2012)。
[0009] 最近,Bie等(2015)篩選出一個(gè)可同時(shí)鑒定6V#2S/6V#4S/6AS/6DS的分子標(biāo)記 MBH1。
[0010] 小麥白粉病是由活體營養(yǎng)白粉菌小麥?;停˙lumeria graminis forma specialis化itici)引起的一種世界性真菌病害,常造成小麥產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失。目前中國 多數(shù)大面積推廣的小麥品種對白粉病的抗性較差,限制了其推廣應(yīng)用的范圍和年限。因此, 選育高抗白粉病的小麥品種和改良目前推廣優(yōu)良小麥品種的白粉病抗性,是防治小麥白粉 病,實(shí)現(xiàn)小麥安全生產(chǎn)最安全、有效的措施。迄今為止,在小麥農(nóng)家品種和野生近緣種中已 經(jīng)發(fā)掘了多個(gè)白粉病抗性基因,并開發(fā)了一些抗病基因的分子標(biāo)記。但白粉菌的生理小種 變異快,很多抗病基因在生產(chǎn)上使用不久就被新的小種所克服??拱追鄄∈切←溣N的一 個(gè)長期而重要的內(nèi)容。來自簇毛麥化aynaldia villosa)的6V#2S · 6AL和6V#4S · 6化易位 系因?qū)π←湴追鄄【猩硇》N免疫,表現(xiàn)出一種廣譜的抗性,目前已被廣泛用于育種 計(jì)劃。一些品種或品系的系譜中包含了 2個(gè)易位系,后代抗源的歸屬有待鑒定。另方面,由于 6V#2S和6V#4S染色體屬于相同同源群,其抗性是否相同一直是個(gè)懸而未解的問題,獲得特 異染色體臂上不同位點(diǎn)的遺傳標(biāo)記有助于對此開展深入的研究。因此,無論對于抗病育種 的輔助選擇,還是對于理論研究,都迫切需要開發(fā)大量特異于目標(biāo)染色體的分子標(biāo)記。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測小麥遺傳背景中是否含有簇毛麥6VS染色 體臂。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明首先提供了檢測或輔助檢測小麥?zhǔn)欠窈写孛?6VS染色體臂的成套試劑,其名稱為成套試劑1。所述成套試劑1由A-P與B-P、C-P、D-P和E-P 中的至少一種組成.
[OOU]所述A-P由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成;
[0014] 所述B-P由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成;
[0015] 所述C-P由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成;
[0016] 所述D-P由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成;
[0017] 所述E-P由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成。
[001引所述成套試劑1中的各單鏈DNA均可獨(dú)立包裝,也可包裝在一起;也可將其中的各 引物對單獨(dú)包裝。所述成套試劑1中各單鏈DNA的摩爾數(shù)比例可W根據(jù)實(shí)際檢測的樣品進(jìn)行 調(diào)整,所述成套試劑1中各單鏈DNA的摩爾數(shù)也均可相同,所述成套試劑1中各引物對的摩爾 數(shù)也均可相同。
[0019] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測小麥遺傳背景中是否含有 簇毛麥6VS染色體臂的引物對,該引物對為所述A-P。
[0020] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測小麥?zhǔn)欠窈写孛?VS 染色體臂的成套試劑,其名稱為成套試劑1-1。所述成套試劑1-1由所述成套試劑1或所述A- P與XI組成;所述XI為F-P、G-P和H-P中的至少一種;
[0021] 所述F-P由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成;
[0022] 所述G-P由序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA組成;
[0023] 所述H-P由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA組成。
[0024] 所述成套試劑1-1中的各單鏈DNA均可獨(dú)立包裝,也可包裝在一起;也可將其中的 各引物對單獨(dú)包裝。所述成套試劑1-1中各單鏈DNA的摩爾數(shù)比例可W根據(jù)實(shí)際檢測的樣品 進(jìn)行調(diào)整,所述成套試劑1-1中各單鏈DNA的摩爾數(shù)也均可相同,所述成套試劑1-1中各引物 對的摩爾數(shù)也均可相同。
[0025] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測小麥遺傳背景中是否含有 簇毛麥6VS染色體臂的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)為系統(tǒng)A1、系統(tǒng)A2或系統(tǒng)A3;
[0026] 所述系統(tǒng)A1由所述成套試劑1與進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器組成;
[0027] 所述系統(tǒng)A2由所述A-P與進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器組成;
[0028] 所述系統(tǒng)A3由所述成套試劑1-1與進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器組成。
[0029] 上述系統(tǒng)中,所述系統(tǒng)A1、所述系統(tǒng)A2和所述系統(tǒng)A3中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑 均可為DNA聚合酶或含有DNA聚合酶的試劑(如2x Taq MasterMix)。^ Taq MasterMix可為 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品,貨號為CW0682A。所述系統(tǒng)Al、所述系統(tǒng)A2和所述系 統(tǒng)A3中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的儀器可為PCR儀。所述PCR儀可為Bio-RAD T100? Thermal Cycler。
[0030] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明還提供了簇毛麥6VS分子標(biāo)記。所述簇毛麥6VS分子 標(biāo)記為分子標(biāo)記al、分子標(biāo)記日2或分子標(biāo)記日3;
[0031] 所述分子標(biāo)記al由A與B、C、D和E中的至少一種組成;
[0032] 所述A為序列17所示的DNA分子,該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述A- P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA分子;
[0033] 所述B為序列18所示的DNA分子,該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述B- P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA分子;
[0034] 所述C為序列19所示的DNA分子,該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述C- P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA分子