eptor superfamily)是一組配體激活的轉錄因子家族，通過在信號分子與轉錄應答間建立聯(lián)系，調控著細胞的生長和分化。RXR在抵御病毒感染的宿主防御中的作用仍然是未知的。我們發(fā)現RXR的過度表達以及其配體的刺激會導致宿主細胞的易感性的水泡口炎病毒VSV的功能缺失或RXR拮抗劑治療使其病毒感染。與這些功能型研究相一致的是，配體刺激RXR在巨噬細胞顯著抑制抗病毒基因的表達，其中包括一型干擾素以及多種干擾素刺激基因。我們的研究已經提供了進一步證據表明，C0X1，其在RXR刺激巨噬細胞中顯著誘導產生，介導RXR對一型干擾素的抑制作用，因此我們發(fā)現了一種新型的RXR-Cox-1依賴性途徑，其在抑制一型干擾素-調節(jié)抗病毒免疫中起到重要作用。這說明，RXR在病毒感染的自身免疫反應中通過下調其表達來抑制抗病毒基因的表達，并在宿主抗病毒反應中起到優(yōu)勢作用。
[0064]各實施例中所使用的RAW264.7細胞系從ATCC公司購得，并給與DMEM加百分之十的FBS以及百分之一的青霉素或鏈霉素共同培養(yǎng)。RAW264.7細胞系從ATCC公司購得，并給與DMEM加百分之十的FBS以及百分之一的青霉素或鏈霉素共同培養(yǎng)。
[0065]本發(fā)明實施例中所使用的水泡型口炎病毒毒株(毒株編號)由UCLA的Lee博士提供。
[0066]將RAW264.7細胞植入6孔板中鋪成6*105，給予DMSO或RXR激動劑或RXR拮抗劑處理16-24小時。病毒傳播同之前描述的一致(Doyle等2002)。在培養(yǎng)基中細胞感染VSV(感染復數=0.01)1小時后，重新更換含有百分之一胎牛血清的DMEM。在第12小時-16小時質檢收集其上清液、MHV68-1UC感染由熒光素酶檢測試劑盒進行定量檢測(Promega)。
[0067]穩(wěn)定的細胞系的構建方法:人RXR克隆到pBABE -嘌呤霉素逆轉錄載體中，重組pBABE-人RXR，pBABE空載體，或pBABE-人RXR共轉染載體psiA48小時。收集病毒上清液用來將人RXR轉換為RAW264.7或F9胚胎癌細胞。感染細胞通過嘌呤霉素(2g/ml)形成轉化株2周后，轉化細胞即成為穩(wěn)定的細胞系。
[0068]無限增值的骨髓源性巨噬細胞制備方法參見Palleroni等1991 ；zhou等2008。
[0069]poly I:C> poly dA: dT 和 siRNA 轉染:
[0070]poly 1:C與poly dA: dT在六孔板轉染，脂質體2000溶解于改良型DMEM培養(yǎng)基5分鐘，2gpoly1:C或2g poly dA: dT溶解于改良型DMEM培養(yǎng)基，將以上脂質體2000溶液以及poly I:C或poly dA: dT溶液混合，室溫培養(yǎng)15分鐘，隨后，混合液加入含有1.6ml新鮮培養(yǎng)基的細胞中。酶聯(lián)免疫吸附法中的轉染試劑(polyplus制備公司)用做小干擾RNA的轉染。根據廠家說明，將1nM對照組小干擾RNA或所示小干擾RNA轉染J2骨髓源性巨噬細胞中。
[0071]統(tǒng)計方法:病毒滴度曲線使用對數秩檢驗進行比較。對于其他數據的統(tǒng)計顯著性，通過 2 tailed unpaired t test, 2-tailed Mann-ffhitney U test 確定 PFU 數據，視情況使用1-way ANOVA corrected多重比較法。P取值小于等于0.05,則被認為在統(tǒng)計學上是顯著的。所有計算均使用GraphPad Software Inc.的Windows的Prism軟件程序。PFU數據中的橫條為各例的平均值，各圖中的誤差條表示結構方程模型(SEM)和重復數據。
[0072]
實施例1 RXR的表達調控著宿主易感性的水泡型口炎病毒的感染:
[0073]我們以往的基因研究已經確立了一種新型的干擾素調節(jié)因子3依賴性但干擾素非依賴性的機制來下調RXR的表達(Chow等2006)。通過不同類型的病毒感染來確定RXR的表達水平，骨髓來源的巨噬細胞被水泡型口炎病毒。結果表明，感染以上病毒后引起RXR的表達下調(如圖1A所示XRXR基因的抑制并不是由于感染后細胞狀態(tài)改變引起，因為L32控制基因沒有變化(數據未顯示)。給予RNA病毒類似物poly I:C和DNA病毒類似物polydA:dT，可以激活細胞內病毒，也顯著抑制在骨髓巨噬細胞中RXR的表達。(如圖1B所示)更重要的是，它證實了這種抑制是宿主反應抗病毒刺激產生而不是病毒直接抑制宿主基因產生的。為了確定RXR在宿主的免疫反應在病毒感染過程中是否起到作用，可以持續(xù)穩(wěn)定的表達人類RXR，逆轉錄病毒感染產生pBABE控制載體。(如圖1C所示)水泡型口炎病毒在人類RXR中感染引起過度表達的Raw264.7細胞系比對照組的細胞病毒載量更多。這個結果在不同的群體之間以及單細胞克隆持續(xù)表達人類RXR之間是一致的(數據未顯示)。這些數據表明RXR的過度表達增加宿主細胞對病毒感染的易感性。
[0074]為了進一步明確RXR在宿主抗病毒感染中的作用，野生型RXR和缺乏F9胚胎癌細胞給予注射水泡型口炎病毒，通過噬菌斑測定RXR缺乏感染后細胞明顯比野生型細胞對水泡型口炎病毒更具有抵抗性。(如圖1E和IF所示)為了確定這種差異是否為RXR依賴性，RXR缺乏F9細胞通過逆轉錄病毒的感染重新建立人類RXR以及pBABE控制載體。給予三種不同的人類RXR注射水泡型口炎病毒比給予RXR缺乏F9細胞系重塑pBABE控制產生更高的病毒滴度。(如圖1G-1H所示)這些結果表明RXR的缺乏降低了水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。
[0075]綜上所述，在RXR過度表達的細胞給予更多病毒感染以及RXR缺乏細胞給予較少的病毒感染，說明RXR表達水平可能調控水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。
[0076]
實施例2
RXR激動劑及其拮抗劑調節(jié)水泡型口炎病毒注射的巨噬細胞的宿主防御功能:
[0077]配體與RXR相結合可以激活其下游通路和充分激活。為了探討RXR配體激活是否能影響病毒感染，RAW264.7細胞給予RXR特異性激動劑Ig268和AGN194204進行過夜預處理，之后感染水泡型口炎病毒。通過菌斑實驗分析，實驗結果與RXR過度表達的實驗結果相一致，配體激活組的RXR給予兩種刺激劑之后顯著增強其水泡型口炎病毒感染水平。(如圖8A所示)與此相似的是，給予9-順式維甲酸(RXR新型配體)治療，也可以增加RAW264.7細胞系對水泡型口炎病毒感染的易感性，并且呈劑量依賴效應(維甲酸劑量范圍16nM-20nM)(如圖2B和8B所示)，相反，當給予特異性RXR拮抗劑HX531后，(如圖2C所示)RAW264.7細胞系出現了對水泡型口炎病毒感染的抵抗增加。感染后我們采用GFP，是考慮到可以通過熒光顯微鏡來觀察感染后細胞的形態(tài)。顯然，與給予DMSO的對照組相比，給予維甲酸處理的細胞VSV感染更多、給予HX531處理的細胞VSV感染較少。(如圖2C所示)F9細胞系，給予AGN194204后增加野生型細胞對病毒的易感性，對RXR缺乏的細胞沒有影響，這一結果說明配體反應是RXR特異性的(如圖2D所示)。為了進一步確定這一特異性配體反應，RXR缺乏F9細胞重新再造給予人類RXR，并選擇單克隆細胞備用。給予AGN194204后，三種單克隆細胞中，RXR缺乏的細胞系通過人類RXR的再造，對病毒感染變得更具易感性。(如圖2E所示)為了研究RXR是否可以調節(jié)VSV蛋白表達，人類RXR過度表達RAW264.7細胞給予9-順式維甲酸和HX531，然后給予其中包含VSV-G熒光素酶受體無法復制的VSV假病毒感染。(Aguilar等2006)。HX531降低VSV熒光素酶受體活化，而9順式維甲酸增加其活化。(如圖2F所示)因為假病毒沒有復制能力，受體表達增加意味著RXR激活病毒蛋白表達的活化。為了分別闡述這一數據，RAW264.7細胞預先給予DMSO處理，野生型VSV給予9順式維甲酸處理，收集其產物，免疫印跡實驗對VSV-G蛋白定量。VSV-G蛋白水平在人RXR過度表達的RAff 264.7細胞中比對照組細胞中表達要高。給予9順式維甲酸細胞組VSV-G蛋白水平顯著上升。(如圖2G所示)基因組的復制是病毒成功復制的另一個關鍵過程。為了檢驗RXR激活是否影響VSV基因組的復制，VSV感染的RAW細胞經過9順式維甲酸預處理提取其RNA，負鏈基因組RNA (VRNA)通過qPCR定量(Simon等2007) RAW264.7細胞給予9順式維甲酸后其VRNA在感染后兩小時內上升，差異在4小時候更加明顯，這些結果表明RXR激活可以提高病毒基因組RNA產生以及病毒蛋白的產生。盡管這兩種過程不是直接相關的，數據表明RXR可能影響病毒周期多種進程?？紤]到RXR通過形成同二聚體或異二聚體來調節(jié)其靶基因，我們通過激動劑與不同的RXR潛在同伴結合，其中包括VDR、LXR、PPAR-a ,PPAR-β以及RAR (類視黃醇受體)(Lefebvre等2010 ；Roszer等2013)。我們發(fā)現只有配體刺激RAR可以促進VSV感染，這也暗示RAR與RXR形成異二聚體，是它的潛在同伴。
[0078]
實施例3
配體激活RXR抑制多種抗病毒基因的表達:
[0079]為了研究RXR是如何減弱宿主免疫反應并有利于病毒感染，本發(fā)明發(fā)明人對給予RXR激動劑預先處理組以及巨噬細胞Poly 1:C轉染組進行了基因芯片檢測。結果表明9順式維甲酸可以抑制多種Poly 1:C誘導基因，其中包括I型干擾素基因(例如IFN1、IFN2、IFN4、IFN5) Isgl5、Ifit3以及Gbp3 (如圖4A)考慮到I型干擾素以及其下游的干擾素刺激基因ISGs在抗病毒感染中對宿主的免疫反應發(fā)揮著重要的作用，RXR介導的對這些抗病毒基因的抑制可能是宿主對病毒感染的易感性引起的。為了驗證基因數據以及證明RXR通過抑制抗病毒基因有利于病毒感染這一假說，本發(fā)明發(fā)明人給與RAW264.7細胞RXR激動劑預處理，或者給予其拮抗劑過夜處理，接著通過Poly I =C轉染來模擬病毒感染刺激細胞。在轉染后2小時，通過給予9順式維甲酸，配體激活RXR對主要抗病毒基因IFNl以及Isgl5顯著抑制(如圖4B所示)。通過抗病毒的刺激，次要干擾素誘導基因例如Gbp-1，0as2，IRF7以及Isg20在該組表達水平也有所降低。(如圖4C所示)給予RXR拮抗劑HX531，一部分但不是全部抗病毒的表達顯著增加。(如圖4B和4C所示)有趣