一種檢測雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明公開一種檢測雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的方法，進一步講是 提供了一種利用雙重巧光定量RT-PCR、采用新一代化qMan MGB探針技術，對雙價腎綜合征 出血熱滅活疫苗進行分型鑒別的方法，屬于生物制品質(zhì)量控制技術領域。
【背景技術】
[0002] 腎綜合征出血熱化FRS)是一種由漢坦病毒化antavirus，HV)引起的，W曬齒類動 物為傳播媒介的嚴重危害人類健康的自然疫源性傳染病，主要臨床癥狀為發(fā)熱、全身出血 W及腎功能損害。該病歷史悠久，流行范圍廣，發(fā)病率高，已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問 題。
[0003] HFRS是危害人類健康最嚴重的病毒性傳染病之一。由于發(fā)病后無有效的治療性藥 物，因此預防接種成為控制該病的關鍵。在雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗的質(zhì)量控制與評 價中常需要進行鑒別試驗，傳統(tǒng)的病毒性疫苗鑒別試驗主要采用常規(guī)血清學方法。2010版 《中國藥典》建立和增訂了部分疫苗的專屬性鑒別試驗，改變了部分生物制品采用效力試驗 替代鑒別試驗的情況，使疫苗質(zhì)量控制得到進一步完善。
[0004] 漢坦病毒傳統(tǒng)的鑒別分型方法多采用交叉空斑減少中和試驗(PRNT)JRNT是比較 經(jīng)典的血清學分型方法，主要是通過衡量相應的中和抗體滴度來確定病毒的型別。該方法 的優(yōu)點是穩(wěn)定、結(jié)果可靠，因此一直沿用至今。但該方法也有一定的不足之處，比如操作繁 瑣，耗時較長，影響因素較多等，因而正逐漸被新興的分型方法所取代。雙價腎綜合征出血 熱滅活疫苗的ELISA快速鑒別試驗，雖然顯示出了很好的特異性和穩(wěn)定性。但由于病毒間抗 原性變異較大，因此有時僅憑個別株型特異性單克隆抗體很難準確分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種檢測雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的方法，通過雙重 巧光定量RT-PCR對雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗進行分型鑒別，方法簡便快速、特異性強 且靈敏度高，是公認的病原體快速檢測金標準。
[0006] 本發(fā)明所述的一種檢測雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的雙重巧光定量 RT-PCR方法，包括W下步驟：
[0007] 1)滅活出血熱病毒的電鏡觀察
[0008] 2)引物和探針的設計
[0009] 共設計了4對引物和2條巧光探針，I型和Π 型各兩對引物和一條探針。序列如下：
[0010] I型引物及探針序列：
[0011] HTNF1:5 '-CAGAGGGAAATCAATGCC-3 '
[0012] HTNR1：5'-CTCATCTGGATCCTTTTCA-3'
[0013] HTNF2:5 '-TATGGAGGAACTACAGAGG-3 '
[0014] HTNR2:5'-TCTGGATCCTTTTCATATTG-3 '
[0015] HTNP: 5 ' -FM-TCTGCATCTCTCACCT-MGB-3 '
[0016] Π 型引物及探針序列：
[0017] 沈0F1:5 '-ATAGCACGCCAGAAAGTC-3 '
[0018] 沈0R1:5 '-ATCCTGTCGGCAAGTTGG-3 '
[0019] 沈0F2:5 '-AAGTCAAGGATGCAGAAAAG-3 '
[0020] 沈0R2:5 '-ATTGTATTGAAGCTGCGACA-3 '
[00別]SE0P:5 '-肥X-CTTAAACAAGAGGACAC-MGB-3 '
[0022] 3)滅活出血熱病毒RNA的提取
[0023] S.lTRIzol法
[0024] 3.2試劑盒法
[0025] 4)陽性對照品的制備
[00%] 4.1目的片段的克隆
[0027] 4.1.1建立逆轉(zhuǎn)錄體系
[002引 4.1.3 PCR產(chǎn)物的回收
[0029] PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片 段，具體過程見試劑盒說明書。
[0030] 4.1.4重組質(zhì)粒 PMD18-T/HTN 和 PMD18-T/SE0 的構(gòu)建
[0031] 4.1.5 D冊α感受態(tài)細胞的制備
[0032] 4.1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
[0033] 從一70°C冰箱中取出D冊α感受態(tài)細胞冰浴融化。加入扣1重組質(zhì)粒。冰浴30min。42 。(:熱擊1.5min。加入40化1 LB液體培養(yǎng)基，37°C，100巧m振蕩培養(yǎng)約化。然后涂布于含有氨 節(jié)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37Γ倒置培養(yǎng)過夜。
[0034] 4.1.7重組質(zhì)粒的大量制備
[00巧]從過夜培養(yǎng)的平皿上挑取單個菌落并接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中。37°C，180巧m 振蕩培養(yǎng)約化。待重組菌生長至對數(shù)期后，利用化KaRa Mini邸ST Plasmid化rification Kit按照操作說明提取質(zhì)粒，并于一20°C保存。
[0036] 4.2目的片段的鑒定
[0037] 4.2.1 PCR 法鑒定
[003引分別W重組質(zhì)粒PMD18-T/HTN和PMD18-T/SE0為模板，擴增體系如下：
[0039]
[0040] 反應條件同前。
[0041] 4.2.2酶切消化法鑒定
[0042] 選擇EcoR I、Hind III兩個酶切位點進行消化。其中，EcoR I酶切位點位于載體 456bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后產(chǎn)生的片段分別為2 785bp和2 8"bpeHind III酶切位點位于載體399bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)化nd III和EcoR I雙酶切后各產(chǎn)生 兩條片段，I型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的片段長度分別為15化P和2 63化ρ，Π 型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn) 生的片段長度分別為20化Ρ和2 63化Ρ。酶切反應體系如下：
[0043] (1化coR I單酶切反應體系，反應體系(2化1)如下：
[0044]
[0045] 混勻上述液體，37°C水浴化。[0046] (2化ind III和EcoR I雙酶切反應體系，反應體系（2化1)如下：
[0047]
[004引
[0049] 混勻上述液體，37°C水浴化。
[0化0] 4.2.3測序鑒定
[0051] 將提取的質(zhì)粒送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。并使用BLAST將測序 結(jié)果與PS-6株和L99株的基因序列進行比對分析。
[0052] 5)雙重巧光定量PCR反應體系和反應條件的確立
[0053] 反應總體積為20μ1，具體如下：
[0化4]
[0055]反應條件如下：
[0056] 預變性94Γ 2min變性94Γ 15s退火6(TClmin 40個循環(huán) [0057]本發(fā)明的積極效果在于:提供了一種新的對雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗進行分 型鑒別的方法，利用雙重巧光定量RT-PCR、采用新一代化qMan MGB探針技術，能夠?qū)鴥?nèi)現(xiàn) 有的雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗(沙鼠腎細胞）、雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗(地鼠腎 細胞）W及雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗(Vero細胞)進行分型鑒別，并且出血熱病毒I型和 Π 型質(zhì)粒檢測的靈敏度分別達到4.68 X l〇icopies/yl和5 X l〇icopies/yl。該方法特異性 很好而且能夠準確分型，可W將其用于雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗的分型鑒別。
【具體實施方式】
[005引通過W下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不W任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改 動或改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內(nèi)。
[0化9] 實施例1:
[0060] 1.滅活出血熱病毒的電鏡觀察
[0061] 利用負染法將滅活純化的出血熱病毒液制備成電鏡標本并在透射電子顯微鏡下 觀察。過程如下：將滅活出血熱病毒懸液滴加到銅網(wǎng)上，室溫吸附數(shù)分鐘，用濾紙吸干多余 的液體，2%醋酸軸負染1~2min后置于H-7650型透射電子顯微鏡下觀察。
[0062] 2.引物和探針的設計
[0063] 漢坦病毒基因是分節(jié)段的單負鏈RNA，基因組分節(jié)段的特點使得病毒很容易發(fā)生 變異。因此，選擇合適的擴增區(qū)域十分重要，即所選擇的區(qū)域不僅要保守而且還應具備較好 的型特異性。核蛋白是病毒進化過程中相對保守的蛋白質(zhì)，其編碼基因也相對保守，且研究 發(fā)現(xiàn)病毒核蛋白中存在許多型特異性的抗原位點，因此本實驗選擇核蛋白編碼基因所在的 S片段作為設計型特異性引物和探針的祀序列。根據(jù)GenBank中已公布的中國HFRS疫苗株及 其他國內(nèi)流行株S片段基因序列，利用DNAMAN軟件進行同源性比對分析，選出一段型內(nèi)相對 保守且型間相對差異的區(qū)域作為擴增的祀?yún)^(qū)域。然后根據(jù)巧光定量PCR引物和探針的設計 原則，利用Primer P;rimie;r5.0和PrimerE邱ress3.0軟件在祀序列的保守區(qū)設計各型特異 性的引物和探針，并利用BLAST進行在線比對分析，最終確定為出血熱I型和Π 型特異的引 物和探針。
[0064] I型參考的毒株主要有Z10株，84FLi株，LR1株及A16株等；Π 型參考的毒株主要有 Z37株，L99株及R22株等。
[0065] 共設計了4對引物和2條巧光探針，I型和Π 型各兩對引物和一條探針。序列如下：
[0066] I型引物及探針序列：
[0067] HTNF1:5 '-CAGAGGGAAATCAATGCC-3 '
[006引 HTNR1:5'-CTCATCTGGATCCTTTTCA-3 '
[0069] HTNF2:5 '-TATGGAGGAACTACAGAGG-3 '
[0070] HTNR2:5'-TCTGGATCCTTTTCATATTG-3 '
[0071 ] HTNP:5 '-FAM-TCTGCATCTCTCACCT-MGB-3 '
[0072] Π 型引物及探針序列：
[0073] 沈OF1:5 '-ATAGCACGCCAGAAAGTC-3 '
[0074] 沈0R1:5 '-ATCCTGTCGGCAAGTTGG-3 '
[00 巧]沈0F2:5，-AAGTCAAGGATGCAGAAAAG-3 '
[0076] 沈0R2:5 '-ATTGTATTGAAGCTGCGACA-3 '
[0077] SE0P:5 '-肥X-CTTAAACAAGAGGACAC-MGB-3 '
[007引 3.滅活出血熱病毒RNA的提取
[0079] 3.1試劑盒法
[0080] 按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit說明書進行，過程如下：
[0081] (1)取20化1雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗液于1.5ml微量離屯、管中。
[0082] (2)加入20化1的Solution A，充分混合均勻后，室溫靜置5min。
[0083] (3)加入75μ1 的Solution B，均勻混合后，12 000巧m離屯、5min。
[0084] (4)吸取步驟(3)中的離屯、上清并轉(zhuǎn)移到新的2ml的Col lection化be中，加入25化 1含1%冰乙酸的異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)混勻。
[0085] (5)將Spin Column置于另一新的2ml的Collection Tube上并將(4)中的混合液轉(zhuǎn) 移至Spin Column