一種具有抗癌活性的opb寡肽及其表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有抗癌活性的寡肽及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Yin Yang 1(YY1)是一個(gè)多功能蛋白，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的活性。YY1帶有一 個(gè)0PB(0ncoprotein Binding)區(qū)域(如圖1所示），可以結(jié)合多個(gè)促進(jìn)癌癥產(chǎn)生及發(fā)展的蛋 白（癌蛋白），包括AKT，Mdm2，ElA和Ezh2。
[0003] 癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程中伴隨著遺傳和表觀遺傳的改變。表觀遺傳是指那些在細(xì) 胞分裂時(shí)不涉及DNA序列變化的可遺傳性狀。表觀遺傳可以協(xié)調(diào)遺傳學(xué)信息在分化與發(fā)育 進(jìn)程中的作用。這些調(diào)節(jié)的缺陷會(huì)導(dǎo)致人類的各種疾病，包括癌癥。YY1參與許多腫瘤形成 過程中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。迄今為止，大多數(shù)的研究表明，YY1的生物學(xué)功能是刺激細(xì) 胞增殖和癌癥的發(fā)生和發(fā)展。
[0004] YY1最早是由Shi等人做為一個(gè)含有414個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合蛋白而被發(fā)現(xiàn)的。做為 一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，YY1具有"陰陽（YinYang)"的特性，即可以抑制或激活靶基因的表達(dá)。YY1在 DNA上的共有結(jié)合元件（consensus binding element)存在于脊椎動(dòng)物的7%基因中，這意 味著YY1在調(diào)節(jié)生物個(gè)體基因表達(dá)上的重要性。很多研究表明，YY1所調(diào)節(jié)的基因具有多種 生物學(xué)功能，包括細(xì)胞生長，分化以及胚胎的發(fā)育。YY1可以結(jié)合多個(gè)參與表觀遺傳學(xué)的重 要蛋白因子，包括調(diào)節(jié)組蛋白乙?；膒300/CBP、PCAF、HDACs，組蛋白甲基化的E Zh2、EZhl、 PRMT4，DNA甲基化的DNMTs。因此，YY1是一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子。
[0005] 在早期的研究中，人們對(duì)于YY1在癌癥發(fā)生中的作用一直不夠明確。直到2004年， 我們發(fā)現(xiàn)了 YY1可以負(fù)調(diào)節(jié)抑癌基因 P53,其促癌或刺激細(xì)胞生長的功能才被意識(shí)到。隨后 的多篇報(bào)道都證實(shí)了 YY1抑制P53的功能，因而，YY1對(duì)p53的負(fù)調(diào)控成為認(rèn)知YY1做為原癌基 因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折。值得注意的是，YY1的這一功能并不依賴于其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性，這也就擴(kuò)展 了 YY1的功能或調(diào)節(jié)范圍。YY1做為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)原癌基因 c-Myc和ERBB2/HER2的表達(dá)，YY1 對(duì)原癌基因 Ezh2功能的促進(jìn)作用，多種生長因子刺激YY1基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及YY1的啟動(dòng) 子帶有原癌基因標(biāo)志性結(jié)構(gòu)G-quadruplex等，被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。這些進(jìn)一步牢固了 YY1的原癌基 因地位和增強(qiáng)了其做為癌癥治療中靶基因的可能性。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)存在的問題：（1)細(xì)菌系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物，可能會(huì)含有內(nèi)毒素，但這個(gè)缺點(diǎn)可 以通過使用針對(duì)去除內(nèi)毒素的方法來解決。（2)基于DNA質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)很難合成太小的多 肽分子，因?yàn)殡y以進(jìn)行分離純化。但合成2X0PB分子也有利于活性多肽的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了提供一種抗癌(尤其是乳腺癌）的物質(zhì)，即提供一種具有抗癌 活性的0ΡΒ寡肽及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的一種具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽，其序列為Gly-Asn-Lys-Lys-Trp-Glu-Gln-Lys-Gln-Val-Gln-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Thr-Met-Trp-Ser- Ser〇
[0009]本發(fā)明的一種具有抗癌活性的OPB寡肽，我們以乳腺癌為例，展示了該寡肽或其任 意一部分寡肽可以用于制備治療癌癥的藥物。
[0010]本發(fā)明的一種具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽的pMBP-2x〇ro表達(dá)載體的構(gòu)建，它是按照 以下步驟構(gòu)建的：
[0011] 一、將2x0PB DNA連接到pUC56載體上，構(gòu)建得到pUC56-2x0PB載體；
[0012] 二、將構(gòu)建的pUC56-2x0PB用限制性內(nèi)切酶Bglll和Xbal在37°C酶切3小時(shí)：
[0013]三、將步驟二酶切得到的2x0PB片段用1 %瓊脂糖電泳膠回收；
[0014]四、將步驟三回收的DNA片段用連接到用限制性內(nèi)切酶Bglll和Xbal酶切后的ρΜΒΡ 載體，得到ρΜΒΡ-2χ0ΡΒ表達(dá)載體；
[0015] 五、將步驟四構(gòu)建的ρΜΒΡ-2χ(ΡΒ表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，培養(yǎng)后，采用限制 性內(nèi)切酶Bgl II和Xbal進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行DNA序列分析驗(yàn)證，對(duì)驗(yàn)證成功的pMBP-2x〇ro表達(dá) 載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21中，即完成所述的具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽的pMBP-2x0PB表達(dá)載 體的構(gòu)建。
[0016] 本發(fā)明構(gòu)建的載體說明如下：
[0017] 包含有以下原件：（1 )MBP(Maltose binding protein)，可以結(jié)合淀粉樹脂 (amylose resin)以便進(jìn)行蛋白分離。（2)PCS序列：是PreScission蛋白酶(PSP)的酶切位 點(diǎn)，在得到MBP-2x0PB后，可以用PSP將2x0PB從融合蛋白上切下。（3)TAT:可以幫助2x0PB穿 過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的信號(hào)肽段。（4)HA:用于HA-抗體識(shí)別的序列。（5)0PB:0n C〇pr〇tein Binding，即我們預(yù)測的具有抗癌作用的多肽序列?；蛘撸@一段為Cont:0PB的亂序序列，用 來做為對(duì)照。（6)終止密碼子(STOP)。
[0018] 本發(fā)明的(PB寡肽來源于YY1的氨基酸201-226區(qū)域，包括Mdm2，Ezh2，ElA和AKT，本 申請(qǐng)將從該區(qū)域獲得肽段命名為原癌基因蛋白結(jié)合(oncogene protein binding;或0ΡΒ) 區(qū)域。
[0019] 本發(fā)明構(gòu)建了在原核細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)的pMBP_2x0PB表達(dá)載體(如圖2所示）。 這一載體可以表達(dá)出帶有MBP和2個(gè)0ΡΒ肽段的融合蛋白MBP-2x0PB，然后通過后期純化和酶 切處理，得到純化的2x0PB肽段。在進(jìn)行這一研究時(shí)，我們也構(gòu)建了一個(gè)用于對(duì)照的表達(dá)質(zhì) 粒pMBP-2xCont，它可以用來合成設(shè)計(jì)成一個(gè)混亂序列的2xCont多肽。
[0020] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0021 ]本發(fā)明通過15年有關(guān)YY1的研究，第一次報(bào)道了YY1促進(jìn)Mdm2介導(dǎo)的p53泛素化降 解；并報(bào)道了 Y Y1的s U Μ 0化（S u m 0 y 1 a t i ο η)對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，Y Y1對(duì)雄激素受體 (androgen receptor)功能的促進(jìn)，尤其是ΥΥ1在乳腺癌細(xì)胞和組織中的高表達(dá)以及對(duì)乳腺 細(xì)胞的增殖作用和其高表達(dá)對(duì)腫瘤形成的必要性，YY1啟動(dòng)子區(qū)域含有癌基因特有的標(biāo)志 性結(jié)構(gòu) G-quadruplex。
[0022]本發(fā)明依據(jù)前期的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)YY1中含有氨基酸201-226的區(qū)域可以結(jié)合多個(gè) 原癌基因，包括Mdm2，Ezh2，ElA,ΑΚΤ，因此，我們命名這一區(qū)域?yàn)?PB(0ncogene Protein Binding)。例如，YY1通過其0ΡΒ區(qū)域與促生長蛋白AKT結(jié)合，并刺激AKT在S473位點(diǎn)的磷酸化 而進(jìn)行激活。YY1介導(dǎo)的AKT激活不依賴于傳統(tǒng)的由PI3K-PIP3介導(dǎo)的AKT激活信號(hào)通路。更 進(jìn)一步，利用0ΡΒ序列合成出的肽段具有抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖的效果，表明基于0ΡΒ的肽 段是一種潛在的治療癌癥藥物的藥物。
[0023] 0ΡΒ肽的優(yōu)勢在于：
[0024] (1)與2XCont相比，2X0PB活性肽段可以特異性地抑制癌細(xì)胞的增值，我們以乳 腺癌為例，展示2 Χ0ΡΒ活性肽段對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，并且不影響正常 乳腺細(xì)胞的生長。這意味著將來利用2 Χ0ΡΒ制成的抑癌藥物應(yīng)該可以選擇性殺傷癌細(xì)胞， 而對(duì)正常細(xì)胞具有較低的毒性或副作用。
[0025] (2)與化學(xué)法多肽合成相比，利用DNA質(zhì)粒在細(xì)菌中發(fā)酵表達(dá)的方法合成多肽，具 有成本低，產(chǎn)量高的特點(diǎn)。一但形成了固定的工序，也是便于操作。
[0026] (3)該肽段便于加入不同的信號(hào)肽段。
【附圖說明】
[0027] 圖1為YY1的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域及0PB(0ncoprotein Binding)區(qū)域的序列；
[0028]圖2為活性多肽的表達(dá)載體示意圖；
[0029] 圖3為2x0PB肽段(帶有HAtag，2μg/ml)在WST-1試驗(yàn)中抑制MCF-7的結(jié)果圖；其中，A 為2 X Cont曲線圖；B為2x0PB肽段曲線圖；
[0030] 圖4為2x〇ro肽段(帶有HAtag，2μg/ml)在WST-1試驗(yàn)中抑制MDA-MB-231的結(jié)果圖； 其中，A為2 X Cont曲線圖；B為2x0PB肽段曲線圖；
[0031 ] 圖5為2x0PB肽段（帶有HAtag，2μg/ml)在WST-1試驗(yàn)中抑制MCF-10A的結(jié)果圖；其 中，A為2x0PB肽段曲線圖；B為2XCont曲線圖；
[0032] 圖6為2x0PB肽段抑制多種乳腺癌細(xì)胞株中的增殖效果圖；其中，A為MCF-10A細(xì)胞； B為 ZR-75-1 細(xì)胞;C為 SK-BR-3 細(xì)胞;D 為MDA-MB-175VII 細(xì)胞;E 為CAMA-1 細(xì)胞;F為 BT-474細(xì) 胞;G為MDA-MB-231細(xì)胞;Η為SUM159細(xì)胞；I為BT-549細(xì)胞;J為HS-578T細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0033] 一:本實(shí)施方式的一種具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽，其序列為Gly-Asn-Lys-Lys-Trp-Glu-Gln-Lys-Gln-Val-Gln-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Thr-Met-Trp-Ser-Ser 〇
【具體實(shí)施方式】 [0034] 二:本實(shí)施方式的一種具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽，該寡肽或其任意一 部分寡肽用于制備治療癌癥的藥物。
【具體實(shí)施方式】 [0035] 三:本實(shí)施方式與二不同的是:所述的寡肽或一部分 寡肽用于制備治療癌癥的藥物。其它與二相同。
[0036]【具體實(shí)施方式】四：本實(shí)施方式的一種具有抗癌活性的01?寡肽的pMBP-2x〇ro表達(dá) 載體的構(gòu)建，它是按照以下步驟構(gòu)建的：
[0037] 一、將2x0PB DNA連接到pUC56載體上，構(gòu)建得到pUC56-2x0PB載體；
[0038] 二、將構(gòu)建的pUC56_2x0PB用限制性內(nèi)切酶Bglll和Xbal在37°C酶切3小時(shí):這個(gè)反 應(yīng)利用了BamHI和Bgl II這兩個(gè)限制性內(nèi)切酶是同尾酶的特性；
[0039]三、將步驟二酶切得到的2x0PB片段用1 %瓊脂糖電泳膠回收；
[0040]四、將步驟三回收的DNA片段用連接到用限制性內(nèi)切酶Bglll和Xbal酶切后的ρΜΒΡ 載體，得到ρΜΒΡ-2χ0ΡΒ表達(dá)載體；
[0041 ]五、將步驟四構(gòu)建的pMBP-2x(PB表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，培養(yǎng)后，采用限制 性內(nèi)切酶Bglll和Xbal進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行DNA序列分析驗(yàn)證，對(duì)形成的菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行篩 選，并用酶切鑒定這些質(zhì)粒中是否帶有插入片段，確定所插入片段的正確性;對(duì)驗(yàn)證成功的 pMBP-2x0PB表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21中，即完成所述的具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽的 pMBP-2x0PB表達(dá)載體的構(gòu)建，用于表達(dá)0ΡΒ多肽。
[0042]同時(shí)本實(shí)施方式按照上述步驟構(gòu)建pMBP-2xCont表達(dá)載體，用來作為實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的 對(duì)照樣品；
[0043]其中，2xCont DNA的核苷酸序列（這個(gè)是編碼兩個(gè)連續(xù)的、將(PB肽段序列弄混亂 后的肽段）D