· L-WaCUOJg · L-WgSOhl.Og · L- ^NOsa.Sg · rt2HP〇4,0.5g · rtH2P〇4,0.01g · r1CaCl2,0.02g · L_1FeS〇4a5g · 月旨，1L 蒸餾水，pH值 7.〇-7.2，121°(：滅菌3〇11^11。
[0029] 將分離所得單菌株進(jìn)行長(zhǎng)鏈烷烴降解功能驗(yàn)證:將純菌株接種于含有1.25g · I/1 正十六烷及1.25g · I/1正十四烷的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)7天，測(cè)定烷烴殘留 量。結(jié)果表明，所分離的單一菌株即錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)Wl對(duì)正十六燒及正十 四烷均具有較高的降解活性。
[0030] 提取長(zhǎng)鏈烷烴（正十六烷和正十四烷混合物)污染土壤經(jīng)電動(dòng)修復(fù)后土壤內(nèi)殘留 的混合底物，將分離的單一菌株接種至含有的該混合底物的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，混合底 物濃度為l.〇g · 震蕩培養(yǎng)7天，混合底物得到有效降解，表明所分離的單一菌株即 蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereUS)Wl對(duì)經(jīng)電動(dòng)修復(fù)后殘留的正十六烷和正十四烷及其不完 全降解產(chǎn)物具有較好的代謝活性。
[0031 ] 所分離的單一菌株即為錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)Wl，已于2015年11月26 日保藏于中國(guó)典型微生物保藏中心，其保藏登錄號(hào)為CCTCC Μ 2015705。蠟樣芽胞桿菌 (Baci 1 lus cereus)Wl屬革蘭氏染色陽(yáng)性菌，菌體細(xì)胞呈桿狀，大小為1 · 0-1 · 2 X 3 · 0-5 · 0μ m，產(chǎn)芽孢，芽孢呈圓形或柱形，無(wú)莢膜，運(yùn)動(dòng)，菌落呈近似圓形，質(zhì)地軟，呈稍有光澤的白色， 屬好氧細(xì)菌，最適生長(zhǎng)溫度為30°C ± 1°C，最適生長(zhǎng)pH為7.2，能利用果糖、葡萄糖，能使明 膠、淀粉水解。
[0032]對(duì)所分離的上述菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：提取上述菌株蠟樣芽胞桿菌 (Bacillus cereus)Wl的總DNA，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌擴(kuò)增通用引物：8f:5'_ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 及 1492r: 5 ' -TACGGHTACCTTGTTACGAC TT-3 ' 1CR反應(yīng)條件為：94 1€5111丨11，94°(：1111丨11，55°(：1111丨11，72 1€3111丨11，35個(gè)循環(huán)，72°(：10111丨11。？〇?產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)與 Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)blast比對(duì)分析可知，序列長(zhǎng)度為1448bp(圖1);所得菌株與錯(cuò)樣芽胞桿菌 (Bacillus cereus)具有較高同源性。
[0033]實(shí)施例2蠟樣芽胞桿菌(Bacillus CereuS)Wl聯(lián)合電動(dòng)修復(fù)對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤 的修復(fù)
[0034] 將蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus)Wl接種于牛肉干蛋白胨培養(yǎng)基中30°C、 180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)3天，5000rpm離心收集菌體，采用pH 7.0的磷酸緩沖液清洗菌體，采用 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基將菌體制備成菌懸液。將錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)W1菌懸液接種于 經(jīng)電動(dòng)修復(fù)后的污染土壤中，污染土壤中的長(zhǎng)鏈烷烴初始含量為正十六烷1 .〇% (W/W)或正 十四烷1.0% (W/W)或二者混合物1.0% (W/W)(正十六烷0.5% (W/W)和正十四烷0.5% (W/ W))，土壤中蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)Wl的濃度為3.6X108CFU · g-1，在土壤濕度為 25 % -30 %，土壤pH為7.3，培養(yǎng)溫度為28-32°C的初始土壤環(huán)境條件下進(jìn)行微生物修復(fù)處 理。
[0035]電動(dòng)修復(fù)處理在1.2V · cnf1電壓梯度下利用倒極的處理方式完成，每2h進(jìn)行一次 電極切換。試驗(yàn)設(shè)置電動(dòng)(EK)、微生物(Bio-Wl)及電動(dòng)聯(lián)合微生物(EK+Bio-Wl)等處理。具 體相關(guān)參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。
[0036]測(cè)定結(jié)果表明：在正十六烷污染土壤中（圖2)，使用蠟樣芽孢桿菌W1在電動(dòng)修復(fù)后 繼續(xù)進(jìn)行微生物修復(fù)的處理組在36天時(shí)的正十六烷降解率達(dá)到57.6% ± 2.0 %，較持續(xù)進(jìn) 行電動(dòng)(EK)及微生物(Bio-Wl)處理組降解率分別提高20.4%和22.8%。同樣地，在正十四 烷污染土壤中（圖3)，電動(dòng)與蠟樣芽孢桿菌W1組合處理組對(duì)正十四烷的降解率達(dá)到66.7% ±2.0%，較EK及Bio-Wl組相比降解率分別提高15.9%和20.4%。蠟樣芽孢桿菌W1在電動(dòng)修 復(fù)后的施用還對(duì)正十六烷與正十四烷混合污染土壤的修復(fù)表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)（圖4)，處理36天時(shí)二 者的總降解率達(dá)到61.0%±3.3%4如1(及扮〇-￥1組分別提高16.0%和17.8%。由此表明， 蠟樣芽孢桿菌W1在電動(dòng)修復(fù)效率出現(xiàn)下降后的時(shí)刻接力進(jìn)行微生物修復(fù)，充分利用其具有 的廣譜代謝能力，有效保證了長(zhǎng)鏈烷烴的快速降解狀態(tài)。由于電動(dòng)修復(fù)后長(zhǎng)鏈烷烴降解的 中間產(chǎn)物一定程度上為蠟樣芽孢桿菌W1提供了碳源及代謝酶誘導(dǎo)物，同時(shí)降低的長(zhǎng)鏈烷烴 濃度也為功能菌株提供了較低選擇壓力的存活環(huán)境，所以使蠟樣芽孢桿菌W1對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴的 降解速率較初始采用微生物修復(fù)(Bio-Wl)相比平均提高0.3% · cf1。
[0037]表 1
[0038]
[0039] 實(shí)施例3蠟樣芽胞桿菌(Bacillus CereUS)Wl聯(lián)合電動(dòng)修復(fù)對(duì)正十六烷的深度降 解作用
[0040] 試驗(yàn)布置如實(shí)施例2,將所制備的蠟樣芽孢桿菌W1菌懸液接種于經(jīng)電動(dòng)修復(fù)后的 污染土壤中，污染土壤中的長(zhǎng)鏈烷烴初始含量為1.0% (W/W)正十六烷。土壤中蠟樣芽胞桿 菌（1^。;[11118。6代118)￥1的濃度為3.6\1080?1].8- 1，在土壤濕度為25%-30%，土壤口!1為 7.3，培養(yǎng)溫度為28-32Γ的初始土壤環(huán)境條件下進(jìn)行微生物修復(fù)處理。電動(dòng)處理同實(shí)施例2 所述。
[0041] 試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如圖5所示，根據(jù)鏈烷烴降解代謝原理，正十六烷經(jīng)氧化脫氫過(guò)程產(chǎn) 生正十六酸，隨后經(jīng)β氧化過(guò)程進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)而被完全礦化。通過(guò)測(cè)定EK及EK+Bio-Wl 處理組中的正十六烷及正十六酸含量可知:在處理36天時(shí)，EK+Bio-Wl組中正十六酸含量占 正十六烷降解含量的53.8 %，較EK組中該比例減小9.3 %，而EK+Bio-Wl組中正十六烷的降 解率卻較EK組高出20.4%，表明更多的正十六酸被代謝進(jìn)入后期降解過(guò)程，這說(shuō)明蠟樣芽 孢桿菌W1對(duì)于正十六烷污染土壤的修復(fù)不只是有利于原始污染底物正十六烷的降解，更有 助于對(duì)正十六烷代謝中間產(chǎn)物的深入降解，從而達(dá)到深層凈化修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的效 果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適合于電動(dòng)修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的中間底物降解菌，其特征在于：中間底物 降解菌為錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)Wl，已于2015年11月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC Μ 2015705。2. -種按權(quán)利要求1所述的適合于電動(dòng)修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的中間底物降解菌的應(yīng) 用，其特征在于：中間底物降解菌蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereUS)Wl用于修復(fù)降解經(jīng)長(zhǎng)鏈 烷烴污染的土壤。3. 按權(quán)利要求2所述的適合于電動(dòng)修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的中間底物降解菌的應(yīng)用， 其特征在于：中間底物降解菌錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)Wl用于采用電動(dòng)修復(fù)降解 經(jīng)長(zhǎng)鏈烷烴污染的土壤。4. 按權(quán)利要求2所述的適合于電動(dòng)修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的中間底物降解菌的應(yīng)用， 其特征在于:所述中間底物降解菌錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)Wl用于采用電動(dòng)修復(fù) 降解經(jīng)長(zhǎng)鏈烷烴污染的土壤的中間底物。5. 按權(quán)利要求2、3或4所述的適合于電動(dòng)修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的中間底物降解菌的 應(yīng)用，其特征在于:所述長(zhǎng)鏈烷烴為正十六烷和正十四烷;所述的中間底物為正十六烷、正 十四烷原始污染物及其降解的中間產(chǎn)物的混合物。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境有機(jī)污染物電動(dòng)修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適合于電動(dòng)修復(fù)長(zhǎng)鏈烷烴污染土壤的中間底物降解菌及其應(yīng)用。中間底物降解菌為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus？cereus)W1，已于2015年11月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC？M2015705。采用本發(fā)明菌株在電動(dòng)修復(fù)過(guò)程中，原始污染底物降解效率下降時(shí)施用篩選得到的蠟樣芽胞桿菌(Bacillus？cereus)W1，可有效提高污染物降解速率，恢復(fù)并延續(xù)高效的長(zhǎng)鏈烷烴及其降解中間產(chǎn)物的降解過(guò)程。CCTCC M 201570520151126
【IPC分類】C12N1/20, C09K17/14, B09C1/10, C12R1/085
【公開(kāi)號(hào)】CN105602869
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610070984
【發(fā)明人】郭書(shū)海, 王卅, 李鳳梅, 楊雪蓮, 王加寧, 張玲妍, 滕菲
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所
【公開(kāi)日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2016年2月1日