核酸釋放劑和干血斑核酸快速提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及核酸釋放劑和干血斑核酸快速提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干血斑（dried blood spot，DBS)，即將全血樣品收集在卡紙上的血液米集方式， 比傳統(tǒng)方法有一定的優(yōu)勢(shì)，它需求的血量較少，方便血樣采集、存儲(chǔ)運(yùn)輸，是罕見(jiàn)疾病篩查 過(guò)程中的一項(xiàng)有效工具。干血斑早在上世紀(jì)六十年代就已被用于苯丙酮尿癥的新生兒篩查 中。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等的發(fā)展，干血斑在遺傳代謝類疾病的診斷及篩查中的應(yīng)用價(jià)值日 漸突顯。截至2015年5月，干血斑主要應(yīng)用于代謝相關(guān)疾病的篩查、藥物動(dòng)力學(xué)研究以及新 生兒篩查等。對(duì)于遺傳代謝性疾病而言，代謝酶、代謝產(chǎn)物和核酸能夠較為穩(wěn)定存在于干血 紙片中，因而在對(duì)代謝異常類疾病樣本進(jìn)行篩查分析時(shí)，干血斑能較為準(zhǔn)確地反映樣本中 代謝酶、代謝產(chǎn)物及核酸的含量。
[0003] 全血樣品的干血斑檢測(cè)廣泛應(yīng)用于臨床疾病檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、刑事偵緝、親子 鑒定等多個(gè)方面。90年代末和二十一世紀(jì)初，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，干血斑核酸的提取方法 有了很大的改進(jìn)，操作更加簡(jiǎn)單，所需設(shè)備少，適合于發(fā)展中國(guó)家及貧窮邊遠(yuǎn)地區(qū)的檢測(cè)。
[0004] PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種用于放大擴(kuò)增特定的 DNA(核酸)片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)， 是能將微量的DNA大幅增加。而研究表明，血紅蛋白中的血紅素可通過(guò)其卟啉環(huán)與Taq酶的 不可逆結(jié)合而抑制Taq酶活性，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果降低，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此能否 有效避免Taq酶活性降低是影響干血斑核酸的提取純度的重要因素。
[0005] 目前應(yīng)用于PCR擴(kuò)增的核酸提取方法主要有5種：（1)傳統(tǒng)煮沸法:裂解液與血液樣 本混勻，高溫裂解，離心得到核酸；（2)濃縮煮沸法:先用多聚糖濃縮沉淀病毒核酸，再加裂 解液煮沸，離心得到核酸；（3)核酸釋放法:核酸釋放劑與血液樣本混合，高溫裂解，得到核 酸；（4)離心柱法:裂解后采用層析柱吸附核酸，再洗脫得到較純的核酸；（5)磁珠法:用磁珠 吸附核酸，再洗脫得到較純的核酸。
[0006] 上述前2種提取方法缺點(diǎn)是需要轉(zhuǎn)管、移液、離心等步驟，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，操作中 難免會(huì)丟失部分核酸，使定量值偏低。離心柱法比前2種煮沸法和核酸釋放法提取的核酸純 度大大提高，但手工操作多，效率低。磁珠法提取步驟簡(jiǎn)單，回收率高，純度好，易于自動(dòng)化， 但產(chǎn)品十分昂貴，目前應(yīng)用并不廣泛。目前來(lái)說(shuō)，核酸釋放法相比來(lái)說(shuō)操作簡(jiǎn)單，成本低廉， 對(duì)后續(xù)熒光定量PCR反應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用，因此應(yīng)用最為廣泛，但并沒(méi)有有效地去除血 紅蛋白等雜質(zhì)，會(huì)影響核酸的提取純度。
[0007] 因此，目前的干血斑的核酸釋放法主要存在不能有效地去除血紅蛋白等雜質(zhì)的問(wèn) 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是目前的干血斑的核酸釋放法主要存在不能有效地 去除血紅蛋白等雜質(zhì)的問(wèn)題。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供了一種核酸釋放劑，由 Tris-HCl、EDTA、MgCl2、Trixon X-100、KCL和蛋白酶K加入無(wú)菌水中混合而成，且各組分的 濃度如下：
[0010] Tris-HCl，10~50mM/L;
[0011] EDTA，1~5mM/L;
[0012] MgCl2，10 ~50mM/L;
[0013] Trixon X-100，l~10mM/L;
[0014] KCL，2~20mM/L;
[0015] 蛋白酶K，0.05~0· lmg/mL。
[0016] 在上述核酸釋放劑中，1^8-!1(：1的?!1值為7.4。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種干血斑核酸快速提取方法，包括以下步驟：
[0018] 制備上述的核酸釋放劑并于-20°C的環(huán)境中儲(chǔ)存；
[0019] 制備血斑樣品圓片:將干血斑采集卡上的血斑樣品制成1個(gè)5 X 5mm的樣本圓片；
[0020] 提取核酸：將所述樣本圓片放入離心管中，再將所述核酸釋放劑升溫至20°C~25 °C的室溫后搖勻加入所述離心管中，浸沒(méi)所述樣本圓片，經(jīng)過(guò)30~45min的56°C溫浴處理 后，轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱中，通過(guò)過(guò)濾得到目標(biāo)核酸。
[0021] 在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述過(guò)濾柱包括上分離管和下收集管，所述 上分離管的上部設(shè)置超濾膜組件，所述下收集管通過(guò)水平的橫管與所述上分離管的底部連 通；
[0022]所述超濾膜組件的材質(zhì)采用三氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、醋酸纖維素、磺化聚砜、 聚醚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亞胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一種或一種以上的組合，所 述超濾膜組件的結(jié)構(gòu)為卷式、平板式、碟管式、中空纖維式或管式。
[0023]在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述超濾膜組件采用的是孔徑為20nm的二氧 化鈦納米濾膜。
[0024]在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述二氧化鈦納米濾膜的制備方法如下： [0025]以孔徑為100nm、孔間距為30~60nm、孔隙率為40%的三氧化鋁無(wú)機(jī)膜作為載體 膜，將所述載體膜經(jīng)過(guò)摻硅二氧化鈦溶膠浸漬，然后進(jìn)行水洗、干燥，在載體膜的孔道內(nèi)外 形成二氧化鈦納米管，得到孔徑為20nm的二氧化鈦納米濾膜。
[0026]在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述摻硅二氧化鈦溶膠的制備步驟如下： [0027] 將異丙酵鈦Ti(0i_C3H7)4和正硅酸乙酯Si(0C 2H5)4合為前驅(qū)體原料，加入到無(wú)水乙 醇中，異丙酵鈦Ti(0i_C3H7)4、正硅酸乙酯Si(0C2H5)4和無(wú)水乙醇的摩爾數(shù)為lmM、lmM、 8.35mM，攪拌并混合均勾形成前驅(qū)體溶液；
[0028] 然后另取摩爾數(shù)為0.5mM的無(wú)水乙醇、0.2mM的硝酸與ImM的水混合呈水解溶液；
[0029] 將水解溶液緩慢滴加到以上的前驅(qū)體溶液中，緩慢水解得到淺黃色的透明的摻硅 二氧化鈦溶膠。
[0030] 在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述三氧化鋁無(wú)機(jī)膜在摻硅二氧化鈦溶膠浸 漬前，用去離子水清洗并以70°C烘干，自然降至20°C~25°C的室溫備用。
[0031]在上述干血斑核酸快速提取方法中，將所述三氧化鋁無(wú)機(jī)膜浸入該溶膠中，5min 后取出干燥，然后升溫至400 °C保溫4h，最后以100 °C /h降至20 °C~25 °C的室溫，備用。
[0032] 在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述上分離管從上到下包括內(nèi)徑依次增大的 進(jìn)口、過(guò)濾段、匯聚段和存儲(chǔ)座，所述超濾膜組件設(shè)置在所述過(guò)濾段內(nèi)，所述下收集管的上 部與所述存儲(chǔ)座的側(cè)面連通
[0033] 本發(fā)明，采用本發(fā)明實(shí)施例提供的核酸過(guò)濾柱及核酸提取試劑定量檢測(cè)干血斑的 核酸含量時(shí)，其操作便捷，只需將待測(cè)樣本和所述核酸釋放劑在離心管中混勻，采用本發(fā)明 提供的核酸釋放劑即可實(shí)現(xiàn)核酸的釋放，并通過(guò)過(guò)濾柱得到較高純度的核酸，免去了傳統(tǒng) 提取技術(shù)中的反復(fù)離心、棄上清和轉(zhuǎn)管等操作，在很大程度上簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了核酸 的丟失，使檢測(cè)靈敏度有了很大的提高，可以對(duì)干血斑等血液樣本中的核酸快速提取純化， 重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、易于判別，且用量少、成本較低、使用安全，適用于不同類型的PCR儀， 可廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)、法醫(yī)學(xué)鑒定、基因突變的檢測(cè)以及組織和血液分型等領(lǐng) 域。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為本發(fā)明和現(xiàn)有對(duì)照試劑QIAamp DNA Micro Kit實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行1.5%瓊脂糖 凝膠電泳后的對(duì)照結(jié)果圖；
[0035] 圖2為本發(fā)明的實(shí)施例1與現(xiàn)有技術(shù)中采用QIAamp Viral RNA Mini Kit的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果的對(duì)照?qǐng)D；
[0036] 圖3為本發(fā)明的實(shí)施例1與現(xiàn)有技術(shù)中采用QIAamp cador Pathogen Mini Kit的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)照?qǐng)D；
[0037] 圖4為本發(fā)明的過(guò)濾柱的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0038]注:圖2和圖3中的粗線代表Qiagen試劑的提取結(jié)果，細(xì)線代表本發(fā)明的提取結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明予以詳細(xì)說(shuō)明。本文中提到的單位mM是指毫摩爾， mM/L是指毫摩爾每升。
[0040] 本發(fā)明提供了一種核酸釋放劑，由Tris-HCl(中文名稱為:三(羥甲基)氨基甲烷； 氨丁三醇；緩血酸銨;三羥甲基氨基甲烷）、EDTA(乙二胺四乙酸）、MgC12(氯化鎂）、Trixon X-100(聚乙二醇辛基苯基醚）、KCL(氯化鉀)和蛋白酶K加入無(wú)菌水中混合而成，且各組分的 濃度如下：
[0041] Tris-HCl，10~50mM/L;
[0042] EDTA，1~5mM/L;
[0043] MgCl2，10 ~50mM/L;
[0044] Trixon X-100，l~10mM/L;
[0045] KCL，2~20mM/L;
[0046] 蛋白酶K，0.05~0· lmg/mL。
[0047] 優(yōu)選的，各組分的濃度如下：
[0048] Tris-HCl，10~20mM/L;
[0049] EDTA，l~2.5mM/L;
[0050] MgCl2，10 ~20mM/L;
[0051] Trixon X-100，l~5mM/L;
[0052] KCL，5~15mM/L;
[0053] 蛋白酶K，0.06 ~0.08mg/mL。
[0054] 優(yōu)選的，1^8-!1(：1的？!1值為7.4。
[0055] 本發(fā)明還提供了一種干血斑核酸快速提取方法，包括以下步驟：
[0056] 制備上述核酸釋放劑并于-20°C的環(huán)境中儲(chǔ)存；
[0057]制備血斑樣品圓片:將干血斑采集卡上的血斑樣品制成1個(gè)5 X 5mm的樣本圓片； [0058]提取核酸：將樣本圓片放入離心管中，再將核酸釋放劑升溫至20°C~25°C的室溫 后搖勻加入離心管中，浸沒(méi)樣本圓片，經(jīng)過(guò)30~45min的56°C溫浴處理后，轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱中， 通過(guò)過(guò)濾得到目標(biāo)核酸。
[0059]優(yōu)選的，如圖4所示，過(guò)濾柱包括上分離管和下收集管5,上分離管的上部設(shè)置超濾 膜組件21，下收集管5通過(guò)水平的橫管51與上分離管的底部連通；
[0060] 超濾膜組件的材質(zhì)采用三氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、醋酸纖維素、磺化聚砜、聚醚 砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亞胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一種或一種以上的組合，超濾膜 組件的結(jié)構(gòu)為卷式、平板式、碟管式、中空纖維式或管式。
[0061] 優(yōu)選的，超濾膜組件采用的是孔徑為20nm的二氧化鈦納米濾膜。
[0062] 優(yōu)選的，二氧化鈦納米濾膜的制備方法如下：
[0063]以孔徑為100nm、孔間距為30~60nm、孔隙率為40%的三氧化鋁無(wú)機(jī)膜作為載體 膜，將載體膜經(jīng)過(guò)摻硅二氧化鈦溶膠浸漬，然后進(jìn)行水洗、干燥，在載體膜的孔道內(nèi)外形成 二氧化鈦納米管，得到孔徑為20nm的二氧化鈦納米濾膜。
[0064]優(yōu)選的，摻硅二氧化鈦溶膠的制備步驟如下：
[0065] 將異丙酵鈦Ti(0i_C3H7)4和正硅酸乙酯Si(0C2H 5)4合為前驅(qū)體原料，加入到無(wú)水乙 醇中，異丙酵鈦Ti(0i_C3H7)4、正硅酸乙酯Si(0C2H5)4和無(wú)水乙醇的摩爾數(shù)為lmM、lmM、 8.35mM，攪拌并混合均勾形成前驅(qū)體溶液；
[0066] 然后另取摩爾數(shù)為0.5mM無(wú)水乙醇、0.2mM硝酸與ImM水混合呈水解溶液；
[0067] 將水解溶液緩慢滴加到以上的前驅(qū)體溶液中，緩慢水解得到淺黃色的透明的摻硅 二氧化鈦溶膠。
[0068]優(yōu)選的，三氧化鋁無(wú)機(jī)膜在摻硅二氧化鈦溶膠