一種水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子OsAnth2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻 雄蕊特異表達(dá)啟動子及其應(yīng)用，該啟動子能夠在作物基因工程中驅(qū)動目標(biāo)基因在雄蕊中特 異表達(dá)，從而可在不影響其他組織部位生理活動的情況下達(dá)到通過改變雄蕊結(jié)構(gòu)特性改良 水稻育性的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因編碼區(qū)的上游。一旦 RNA聚合酶定位并結(jié)合在啟動子上即可啟動轉(zhuǎn)錄過程，它與RNA聚合酶以及其它蛋白輔助因 子等反式元件的相互作用是基因表達(dá)調(diào)控模式的實(shí)質(zhì)。在啟動子上游通常會有一些特殊的 DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。因此啟動子是 基因表達(dá)所必需的，從某種意義上講其序列特征和一些特異轉(zhuǎn)錄因子的相互作用決定了外 源基因表達(dá)的空間、時間和表達(dá)的強(qiáng)度等。深入研究這些啟動子不僅有助于闡明植物形態(tài)、 發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價值。
[0003] 此外，利用高效的組織特異型啟動子代替組成型啟動子，改良水稻的抗性或品質(zhì)， 使一些表達(dá)毒性蛋白的目的基因盡量在水稻的營養(yǎng)器官表達(dá)，而不在生殖器官表達(dá)，從而 增加轉(zhuǎn)基因水稻的食用安全性和環(huán)境安全性，降低組成型啟動子表達(dá)所造成的能量損失， 以及對環(huán)境和水稻本身帶來的不良影響，是水稻轉(zhuǎn)基因工作今后將要解決的一個重要問 題，也是轉(zhuǎn)基因水稻從實(shí)驗(yàn)室走向大田生產(chǎn)的必要前提。
[0004] 水稻的雄蕊是水稻的生殖器官，是雄性配子體產(chǎn)生的器官，與水稻穗的發(fā)育、育種 及水稻的產(chǎn)量等密切相關(guān)。因此在水稻組織特異型啟動子的研究領(lǐng)域中，雄蕊特異型啟動 子是人們最為關(guān)注的啟動子之一。但是目前所發(fā)現(xiàn)的雄蕊特異型啟動子的遺傳資源并不是 十分豐富，限制了人們對雄蕊性狀改良能力的提升。因此，本發(fā)明希望提供一種水稻雄蕊特 異表達(dá)啟動子，用于驅(qū)動目標(biāo)基因在雄蕊中特異性表達(dá)，達(dá)到改良育性的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在水稻雄蕊特異表達(dá)的啟動子、獲得含有 該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子以及該啟動子的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子，其DNA序 列與SEQ ID No: 1所示的DNA序列有80%或90%以上的同源性;或者，所述水稻雄蕊特異表 達(dá)啟動子為在SEQ ID No: 1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷 酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者所述水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交的產(chǎn)物。這些水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子序列與SEQ ID No: 1所示的 DNA序列具有相同功能，即驅(qū)動目標(biāo)基因在水稻雄蕊中表達(dá)。
[0007] 優(yōu)選地，所述水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子包含序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序 列。序列表中SEQ ID No:l所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的序列，本文中稱為OsAnth2或啟動子OsAnth2。具體而言，本申請的發(fā)明人 從日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)分離克隆得到了序列表中SEQ ID No:l所 示的DNA序列，并發(fā)現(xiàn)這段1907bp的DNA序列具有驅(qū)動目標(biāo)基因在水稻雄蕊特異表達(dá)的作 用。
[0008] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子的DNA序列為SEQ ID No: 1所示的 序列，即0sAnth2或啟動子0sAnth2。
[0009] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0010] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的水稻 雄蕊特異表達(dá)啟動子，在所述重組表達(dá)載體中，所述水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子連接于待表 達(dá)的基因序列的上游；優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚US基因，所述重組表達(dá)載體為 pCAMBIA1391-〇sAnth2,該重組表達(dá)載體為將SEQ ID No:l所示的序列即0sAnth2或啟動子 0sAnth2構(gòu)建于pCAMBIAl 391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為pCAMBIAl 391 -0sAnth2。
[0011] 或者待表達(dá)基因可以為任何對水稻的雄蕊性狀具有改善能力的基因。通過本發(fā)明 的啟動子驅(qū)動該基因在雄蕊中特異性地集中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)針對性改善作物雄蕊相應(yīng)性狀 的功能，而不會對植物體內(nèi)其他組織或器官帶來任何不利影響。
[0012] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng) 用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述水稻雄蕊特異表達(dá)啟動子連接于載體的待表達(dá)的基 因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插入目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載體， 將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0013] 再一方面，所述應(yīng)用可以改良作物生長特性，所述作物為禾谷類作物:水稻、小麥、 高粱、大麥、燕麥、黑麥等;優(yōu)選為水稻。
[0014] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括：
[0015] A)、以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴(kuò)增所述水稻雄蕊特 異表達(dá)啟動子0sAnth2;
[0016] B)、將所擴(kuò)增的目的片段與目標(biāo)基因相連，進(jìn)而獲得相應(yīng)重組載體；
[0017] C)、利用凍融法將所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中；
[0018] D)、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法利用所獲得的根癌農(nóng)桿菌對成熟水稻種子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn) 化；
[0019] E)、利用轉(zhuǎn)化后的水稻種子培育相應(yīng)的水稻植株。
[0020] 本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID N〇:l中相同）：
[0021 ] g^CgCrGXO^^CTGTr^CCrgTTTGTACTGTTTAGGTGGGGAGCCAGGTAAACATAAAATTCAG GGAATAGGGCCAGGACTCATACCTGATATGTTGGACACCTCGGTCATCGATGAAGTCGTCACGGTAAACACTGATGA AGCAATGGTGAATGCAAGGAGGCTGGCAATGGAAGAGGGCCTCCTTATGGGCATTTCTTCTGGGGCAAACCTGGCAG CTTGCTTGAAGGTTCAAAATCTCCTAGCAACTCATCTGTCTGAATGTTTATTCCTTTTCTTATCTCTAGTAATCTTC TCCTATCGAAAATTTTTGCACATCCTTTCCTCTAATAACATTGAAATCTCAAATGCATATTTAGGTCGCGTCGAGAG AGGAAAACAAGGGGAAGATGATTGTCACCATGTTCCCAAGCGGGGGTGAGAGGTACATGAACTCTGACCTCTTTGCA GCTGTGAGAGAGGAATGCAATGCCATGACATTTTAATCTCACTGGTTGTTCAGAAGAATCAAGAACAGTTATGTGTA AAACTATAGGAGGGTAACTTGTACCACAATGTACACATAGCACGATCTTGCAAAGGGATTTATCGGCAAGGAGCCAA AGAATTTGTACGAATTGTATATTTGTACTAGTCATTAGTCAATAAATAAATGAAATAATTTGCTCACTTCGTGTGAG TAAATTTCGGAAAACTACATATACTTGTCATAAACTACAGATCAAATGATATTATCATAAAACTACCAATTTAGAGC CCTTTTGAATTGGAGGATTGCCATAAGAATTTTAGAGAATTCAATTTCCTAAGGAATTTTGCATATGAAACCCTTTG ATTCATAGAAAAGTATAGGAAATTTTTCATAGGATTACATTCCTATAGCTCAATTTCACATGAAAATAAGCAAGAGG TTTAACCTCTTGAAAACTTTTATTTGCTTTATTTGTTTCCTATGGTACTACCAAAGGGACTCTTTATATTTTTTTTT GTGTCTTCCATTCCTATAGAATTAGGAAAACATGTCAATTCGATTCCTACGTTTTTCC