基于CRICPR-Cas9體外改造腺病毒載體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種基于CRICPR_Cas9體外改造腺病毒載體的方 法，特別涉及一種基于CRICPR-Cas9體外改造5型腺病毒纖毛基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 5型腺病毒(Adenovirus type 5，Ad5)是目前應(yīng)用于各種重大疾病臨床前治療和 臨床治療研究的主要運(yùn)載工具。腺病毒的纖毛由尾巴、桿、頭節(jié)3部分組成，在感染細(xì)胞過(guò)程 中發(fā)揮重要的作用，腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程開(kāi)始于纖毛的頭節(jié)結(jié)合細(xì)胞表面的特異性受 體，不同血清型的腺病毒所識(shí)別的細(xì)胞表面受體存在較大差異（Nicklin S A，Wu E， Nemerow G R,et al.The influence of adenovirus fiber structure and function on vector development for gene therapy[J] .Mol Ther. 2005,12(3): 384-393·)。通過(guò)將5 型腺病毒中編碼纖毛頭節(jié)和桿區(qū)的基因與其他血清型腺病毒纖毛頭節(jié)和桿區(qū)編碼基因進(jìn) 行替換重組，形成嵌合型腺病毒載體，能夠顯著提高病毒感染特定類型細(xì)胞的效率。比如35 型腺病毒結(jié)合細(xì)胞的天然受體是CD46,該分子在T淋巴細(xì)胞中有較高水平表達(dá)。Ad5F35嵌合 型腺病毒能在保留Ad5的所有特性基礎(chǔ)上顯著提高感染T淋巴細(xì)胞的效率（Schroers R， Hildebrandt Y,Hasenkamp J,et al.Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35chimeric adenoviral vectors[J]·Exp Hematol. 2004，32(6): 536-546.) jdSFl 1嵌合型腺病毒則能顯著提高感染細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺 傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIK)的效率（Stecher H，Shayakhmetov D M， Stamatoyannopoulos G,et al.A capsid-modified adenovirus vector devoid of all viral genes: assessment of transduction and toxicity in human hematopoietic cells[J].Mol Ther.2001,4(1):36-44.)。然而腺病毒載體其基因組全長(zhǎng)36Kb，用常規(guī)的分 子生物學(xué)手段很難找到合適的限制性酶切位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行改造。
[0003] 規(guī)律成族間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat;CRISPR_associated，CRISPR_Cas9)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的復(fù) 合體，識(shí)別特定的DNA序列，進(jìn)行特定位點(diǎn)切割造成DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks， DSB)。這一技術(shù)由于能快速、簡(jiǎn)便、高效地靶向基因組任何基因，已被廣泛用于細(xì)胞水平、動(dòng) 物水平研究。理論上Cas9蛋白在sgRNA(single guide RNA)的引導(dǎo)下可以切割任何存在NGG (以及NAG)間隔相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM)的上游DNA〇
[0004] 目前，尚未有基于CRICPR-Cas9基因編輯技術(shù)體外改造5型腺病毒載體制備Ad5F35 嵌合型腺病毒的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決大質(zhì)粒載體用常規(guī)的分子生物學(xué)手段很難找到合適的限制性酶切位點(diǎn) 對(duì)其進(jìn)行改造的問(wèn)題，以及點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)超過(guò)l〇kb的大載體進(jìn)行突變時(shí)容易引起二次突 變（由于PCR酶保真性引起的隨機(jī)突變）的技術(shù)難點(diǎn)，本發(fā)明提供一種適用于大質(zhì)粒載體改 造的分子克隆方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的分子克隆方法，具體可為如下三種中的任一種：
[0007] 第一種:將出發(fā)質(zhì)粒的靶標(biāo)基因替換為目的基因得到重組環(huán)形質(zhì)粒的方法，具體 可包括如下步驟：
[0008] (a)以所述出發(fā)質(zhì)粒上所述靶標(biāo)基因的起始區(qū)域中符合5'-Nx-NGG-3'或5'-CCN-Nx-3'序列排列規(guī)則的序列中的"Nx"所示序列為靶序列1;以所述出發(fā)質(zhì)粒上所述靶標(biāo)基因 的終止區(qū)域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列規(guī)則的序列中的"Nx"所示序列為 靶序列2;N表示A、G、C和T中的任一種，14SXS30,且X為整數(shù)(如X為18或20)，Nx表示X個(gè)連 續(xù)的脫氧核糖核苷酸；
[0009] 針對(duì)所述靶序列1設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA1，所述雙鏈DNA1中的一條鏈與所述靶序列1反 向互補(bǔ);針對(duì)所述靶序列2設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA2,所述雙鏈DNA2中的一條鏈與所述靶序列2反 向互補(bǔ)；
[0010] (b)將所述雙鏈DNA1和所述雙鏈DNA2分別構(gòu)建至能夠轉(zhuǎn)錄向?qū)NA的載體中，經(jīng)體 外轉(zhuǎn)錄獲得特異于所述靶序列1的向?qū)NA1和特異于所述靶序列2的向?qū)NA2;
[0011] (c)采用Cas9蛋白、所述向?qū)NA1和所述向?qū)NA2切割所述出發(fā)質(zhì)粒，獲得切除了 所述靶標(biāo)基因的所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段；
[0012] (d)根據(jù)所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段 的上下游末端部分的序列，設(shè)計(jì)并合成自5'端到3'端依次為上游同源臂、所述目的基因、下 游同源臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列與所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段的3'端序列相同； 所述下游同源臂的序列與所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段的5'端序列相同；
[0013] (e)將步驟(d)獲得的兩端分別帶有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段 與所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段進(jìn)行同源重組，完成所述目的基因與所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段 的連接，即獲得將所述出發(fā)質(zhì)粒的所述靶標(biāo)基因替換為所述目的基因的重組環(huán)形質(zhì)粒。
[0014] 第二種:在出發(fā)質(zhì)粒的靶標(biāo)片段中插入目的基因得到重組環(huán)形質(zhì)粒的方法，具體 可包括如下步驟：
[0015] (a)以所述出發(fā)質(zhì)粒上所述靶標(biāo)片段中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排 列規(guī)則的序列中的"Nx"所示序列為靶序列;N表示A、G、C和T中的任一種，14 < X < 30，且X為 整數(shù)(如X為18或20)，Nx表示X個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸；
[0016] 針對(duì)所述靶序列設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA，所述雙鏈DNA中的一條鏈與所述靶序列反向互 補(bǔ)；
[0017] (b)將所述雙鏈DNA構(gòu)建至能夠轉(zhuǎn)錄向?qū)NA的載體中，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得特異于所 述靶序列的向?qū)NA;
[0018] (c)采用Cas9蛋白和所述向?qū)NA切割所述出發(fā)質(zhì)粒，獲得在所述靶標(biāo)片段中被切 開(kāi)的線性出發(fā)質(zhì)粒；
[0019] (d)根據(jù)所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述線性出發(fā)質(zhì)粒的上下 游末端部分的序列，設(shè)計(jì)并合成自5'端到3'端依次為上游同源臂、所述目的基因、下游同源 臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列與所述線性出發(fā)質(zhì)粒的3'端序列相同；所述下游同源 臂的序列與所述線性出發(fā)質(zhì)粒的5'端序列相同；
[0020] (e)將步驟(d)獲得的兩端分別帶有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段 與所述線性出發(fā)質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，完成所述目的基因與所述線性出發(fā)質(zhì)粒的連接，即獲 得在所述出發(fā)質(zhì)粒的所述靶標(biāo)片段中插入所述目的基因的重組環(huán)形質(zhì)粒。
[0021]第三種:將出發(fā)質(zhì)粒的靶標(biāo)基因缺失得到重組環(huán)形質(zhì)粒的方法，具體可包括如下 步驟：
[0022] (a)以所述出發(fā)質(zhì)粒上所述靶標(biāo)基因的起始區(qū)域中符合5'-Nx-NGG_3'或5'-CCN- Nx-3'序列排列規(guī)則的序列中的"Nx"所示序列為靶序列1;以所述出發(fā)質(zhì)粒上所述靶標(biāo)基因 的終止區(qū)域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列規(guī)則的序列中的"Nx"所示序列為 靶序列2;N表示A、G、C和T中的任一種，14SXS30,且X為整數(shù)(如X為18或20)，Nx表示X個(gè)連 續(xù)的脫氧核糖核苷酸；
[0023] 針對(duì)所述靶序列1設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA1，所述雙鏈DNA1中的一條鏈與所述靶序列1反 向互補(bǔ);針對(duì)所述靶序列2設(shè)計(jì)合成雙鏈DNA2,所述雙鏈DNA2中的一條鏈與所述靶序列2反 向互補(bǔ)；
[0024] (b)將所述雙鏈DNA1和所述雙鏈DNA2分別構(gòu)建至能夠轉(zhuǎn)錄向?qū)NA的載體中，經(jīng)體 外轉(zhuǎn)錄獲得特異于所述靶序列1的向?qū)NA1和特異于所述靶序列2的向?qū)NA2;
[0025] (c)采用Cas9蛋白、所述向?qū)NA1和所述向?qū)NA2切割所述出發(fā)質(zhì)粒，獲得切除了 所述靶標(biāo)基因的所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段；
[0026] (d)根據(jù)所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，設(shè)計(jì)并合成自5'端 到3'端依次為上游同源臂和下游同源臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列與所述出發(fā)質(zhì) 粒的骨架片段的3'端序列相同；所述下游同源臂的序列與所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段的5'端 序列相同；
[0027] (e)將步驟(d)獲得的兩端分別帶有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段 與所述出發(fā)質(zhì)粒的骨架片段進(jìn)行同源重組，即獲得將所述出發(fā)質(zhì)粒的所述靶標(biāo)基因缺失的 重組環(huán)形質(zhì)粒。
[0028] 其中，所述向?qū)NA(或所述向?qū)NA1或所述向?qū)NA2)為由crRNA和tracrRNA通過(guò) 部分堿基配對(duì)結(jié)合而成的具有回文結(jié)構(gòu)的RNA;所述crRNA含有能夠與所述靶序列（或所述 靶序列1或所述靶序列2)互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段。
[0029] 在上述方法的步驟(a)中，所述靶標(biāo)基因的起始區(qū)域?yàn)?