轉(zhuǎn)SmMYB75基因提高丹參毛狀根中丹酚酸含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，特別涉及一種轉(zhuǎn)SmMYB75基因提高丹參毛狀根中丹酚 酸含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]心腦血管疾病是目前威脅全人類健康與生命的"頭號(hào)殺手"。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年 大約有1700萬人死于心腦血管疾病，約占全球總死亡人數(shù)的1/3,我國(guó)每年大約有300萬人 死于心腦血管疾病，因此，積極研究高效、低毒和廉價(jià)的治療心腦血管疾病的臨床藥物對(duì)提 高人類健康水平具有十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003] 丹參(Salvia miltiorrhiza)，為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬多年生草本植株，以 其干燥的根或塊莖入藥，被廣泛地應(yīng)用于治療心腦血管疾病，是一種傳統(tǒng)的中草藥植株。丹 參的生物活性成分主要分為兩大類:一類為水溶性的酚酸類化合物，主要包括丹酚酸A、丹 酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹參素等；另一類為脂溶性的丹參酮類化合物，主要包 括丹參酮I、丹參酮ΠΑ、隱丹參酮、二氫丹參酮等。
[0004] 丹參中的丹酚酸在預(yù)防人類疾病方面發(fā)揮著重要的作用，其生物學(xué)活性主要包括 抗氧化、抗凝活性、腎臟功能的調(diào)節(jié)、肝臟的保護(hù)、心血管的保護(hù)、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎 癥等。除此之外，丹酚酸還具有抗缺血再灌注、抗血栓、降血壓和抗纖維化的作用。在中國(guó)， 丹參通常被制作為藥劑，如片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑、口服液、噴霧、滴丸等，具有極高的 藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，在傳統(tǒng)的栽培模式下，丹參長(zhǎng)期栽培時(shí)品質(zhì)退化嚴(yán)重、活性成分含 量降低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)及易受栽培區(qū)域和環(huán)境等制約;在化學(xué)合成過程中，丹酚酸的化學(xué)合成 過程十分繁瑣，成本較高且易造成環(huán)境污染;在離體條件下通過細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞， 其藥用活性成分積累量很低而且穩(wěn)定性很差，遠(yuǎn)達(dá)不到商業(yè)化開發(fā)利用的要求。因此，為了 緩解具有重要臨床需求的丹酚酸藥源的緊缺性問題，亟待發(fā)明一種提高丹酚酸含量的新方 法，代謝工程的迅速發(fā)展與毛狀根培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟為提高丹參毛狀根中丹酚酸成分的 含量，解決丹參酮藥源緊缺性問題提供了 一條新思路。
[0005] 已有研究表明，植物中的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與到植物的次生代謝過程，因 此挖掘丹參自身的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子來提高丹酚酸的含量具有重大的意義。利用基因工程 手段，將丹參轉(zhuǎn)錄因子SmMYB75基因遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片獲得SmMYB75過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因丹參毛 狀根，同時(shí)上調(diào)丹酚酸的生物合成，獲得丹酚酸高產(chǎn)的丹參毛狀根根系，為商業(yè)化生產(chǎn)丹酚 酸提供新型優(yōu)質(zhì)藥源。目前尚未發(fā)現(xiàn)通過SmMYB75基因過表達(dá)策略提高丹參毛狀根中丹酚 酸含量的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的，就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種轉(zhuǎn)SmMYB75基因 來提高丹參毛狀根中丹酚酸含量的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明從丹參中克隆得到645bp的SmMYB75基因，構(gòu)建原核表達(dá)的載體，在大腸桿 菌中表達(dá)SmMYB75基因重組蛋白；定量PCR分析其在不同組織和甲基茉莉酸誘導(dǎo)后的基因的 表達(dá)量;構(gòu)建亞細(xì)胞定位的載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，激光共聚焦顯微鏡觀察定量SmMYB75 基因在細(xì)胞中的定位情況;構(gòu)建植物表達(dá)載體，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片獲 得轉(zhuǎn)基因的毛狀根;PCR檢測(cè)目的基因 SmMYB75的整合情況;定量PCR分析插入基因 SmMYB75 及丹酚酸生物合成相關(guān)基因在毛狀根中的表達(dá)情況;高效液相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹 酚酸的含量。
[0009] 一種轉(zhuǎn)SmMYB75基因提高丹參毛狀根中丹酚酸含量的方法，包括以下步驟：
[0010] (1)采用基因克隆方法從丹參中克隆獲得基因 SmMYB75,所述的SmMYB75基因序列 如SEQ ID: 1所示，對(duì)其進(jìn)行序列分析。
[0011] (2)根據(jù)丹參SmMYB75基因序列，把SmMYB75基因可操作性地構(gòu)建于原核表達(dá)的載 體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè);所述的載體為pET-30a( + )， 大腸桿菌為菌株R〇setta(DE3)。
[0012] (3)根據(jù)丹參SmMYB75基因序列，設(shè)計(jì)定量PCR的引物，對(duì)SmMYB75在丹參的不同組 織中的表達(dá)量及其對(duì)甲基茉莉酸調(diào)控的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行分析。
[0013] ⑷將SmMYB75基因構(gòu)建于亞細(xì)胞定位的載體，轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，進(jìn)行煙草葉片的 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，對(duì)SmMYB75基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;所述的載體為pM0N530，根瘤農(nóng)桿菌為菌株 Ase〇
[0014] (5)把SmMYB75基因可操作性地構(gòu)建于表達(dá)調(diào)控序列，形成含SmMYB75基因的植物 表達(dá)載體;植物表達(dá)載體為經(jīng)過改造獲得的PCAMBIA2300+載體，包含CaMV35S啟動(dòng)子和終止 子、多克隆位點(diǎn)、復(fù)制起始點(diǎn)及卡那霉素抗性位點(diǎn)。
[0015] (6)將步驟(5)所得的含SmMYB75基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1，獲得 用于轉(zhuǎn)化丹參的含SmMYB75基因植物表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。
[0016] (7)利用步驟(6)所構(gòu)建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化丹參葉片，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)為 陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆;所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的陽性轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根是指:設(shè)計(jì)發(fā)根位點(diǎn) 基因 BrolB的上下游引物和在插入基因 SmMYB75內(nèi)部及N0S終止子內(nèi)部設(shè)計(jì)上游及下游特異 性引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的根系即為陽性轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根根系。
[0017] (8)定量PCR測(cè)定步驟(7)獲得的丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根中SmMYB75基因及丹酚酸生物 合成途徑相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，并篩選出過表達(dá)SmMYB75基因根系中SmMYB75基因的表達(dá) 量提高的根系;具體方法為:對(duì)PCR鑒定為陽性的毛狀根克隆進(jìn)行總RNA的提取，統(tǒng)一定量到 〇.5yg RNA，反轉(zhuǎn)錄成25μ1體系的cDNA，分別設(shè)計(jì)插入目的基因及看家基因 SmActin的定量 引物，以相同量的cDNA為模板進(jìn)行定量PCR分析SmMYB75及丹酚酸生物合成相關(guān)基因的相對(duì) 表達(dá)量情況。
[0018] (9)高效液相色譜法測(cè)定步驟(8)中丹參轉(zhuǎn)SmMYB75基因毛狀根中丹酚酸的含量， 篩選丹酚酸含量顯著提高的丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根根系;所述的方法為:色譜柱C-18反相硅膠 柱，流動(dòng)相為體積比30:70的乙腈和水，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.03;檢測(cè)波長(zhǎng)281nm，柱溫35°C， 流速lml/min，進(jìn)樣量20μ1。
[0019] 本發(fā)明綜合應(yīng)用生物學(xué)和基因技術(shù)方法如載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測(cè)、定量 PCR分析、丹酚酸的提取及含量測(cè)定等，發(fā)明了一種利用丹參的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SmMYB75 基因提高丹參毛狀根中丹酚酸的方法。本發(fā)明獲得的過表達(dá)SmMYB75轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根根 系中最高表達(dá)量為總丹酚酸含量為167.25mg/g干重，是對(duì)照組(73.7mg/g干重）的2.26倍。 本發(fā)明為商業(yè)化大量生產(chǎn)丹酚酸及降低藥品價(jià)格提供了可能，也為大量生產(chǎn)丹酚酸臨床藥 物的大量需求提供了重要來源。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1、顯著提高丹參毛狀根中丹酚酸的含量。
[0022] 2、發(fā)明方法效果可靠。
[0023] 3、獲取丹酚酸的成本低。
[0024] 4、生產(chǎn)過程無環(huán)境污染。
【附圖說明】
[0025] 圖 1 為pCAMBIA2300+: :SmMYB75載體構(gòu)建示意圖。
[0026] 圖2為重組蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。
[0027] 圖3為丹參SmMYB75的組織表達(dá)分析。
[0028] 圖4為丹參SmMYB75在甲基茉莉酸處理下的表達(dá)分析。其中，Control為乙醇對(duì)照組 誘導(dǎo)，MJ為甲基茉莉酸誘導(dǎo)。
[0029]圖5為SmMYB75的亞細(xì)胞定位的分析結(jié)果圖。GFP，綠色熒光蛋白；Bright，明場(chǎng)； Merged，綠色熒光蛋白與明場(chǎng)的合并圖；pM0N530: :GFP，空載體熒光表達(dá)；pM0N530:: SmMYB75-GFP，SmMYB75的瞬時(shí)熒光表達(dá)。
[0030]圖6為SmMYB75在轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中的表達(dá)分析結(jié)果圖。其中，Control為C58C1 侵染獲得的毛狀根。
[0031]圖7為丹酸酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果圖。其中，Empty vector是空載 體。
[0032]圖8為SmMYB75轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中丹酚酸的含量檢測(cè)結(jié)果圖。其中，Empty vector是空載體。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。圖1為PCAMBIA2300+:: SmMYB75載體構(gòu)建示意圖。圖2為重組蛋白SmMYB75的SDS-PAGE分析。
[0034] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的條件，或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說明書建議 的條件。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 丹參SmMYB75基因的克隆
[0037] 1 · 1 ·丹參總RNA的提取
[0038] 取少量丹參幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，然后按照TIANGEN公司提 供的RNAprep Pure Plant Kit使用說明書提取總RNA。用普通瓊脂糖