一對(duì)用于貝西滑刃線蟲pcr檢測的特異性引物及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物線蟲檢疫鑒定領(lǐng)域，提供了 1對(duì)用于貝西滑刃線蟲PCR檢測的特異 性引物及其使用方法，具體而言，所述方法通過組合使用新設(shè)計(jì)的貝西滑刃線蟲的特異性 引物W及已報(bào)道的植物寄生線蟲核糖體口 S區(qū)通用擴(kuò)增引物，在1/10條線蟲DNA的靈敏度水 平上建立了一種新的用于檢測貝西滑刃線蟲的雙重PCR檢測方法，適用于口岸及農(nóng)林業(yè)相 關(guān)檢疫鑒定實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 貝西滑刃線蟲(A地elenchoides besseyi Qiristie, 1942)是一種重要的遷移性 植物外寄生線蟲，其寄主范圍設(shè)及35個(gè)屬W上的高等植物，主要侵染水稻、谷子、草替等經(jīng) 濟(jì)作物，導(dǎo)致作物品質(zhì)下降并引起大面積減產(chǎn)。該線蟲抗逆性強(qiáng)，可長期潛伏于繁殖材料 中，主要通過帶病種子調(diào)運(yùn)傳播擴(kuò)散。自上世紀(jì)40年代傳入我國后，貝西滑刃線蟲現(xiàn)已在多 個(gè)省份發(fā)生危害，對(duì)國內(nèi)水稻和谷子生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。
[0003] 傳統(tǒng)方法鑒定貝西滑刃線蟲主要基于形態(tài)學(xué)特征，由于滑刃屬線蟲種類繁多，形 態(tài)特征復(fù)雜多變，再加上貝西滑刃線蟲與其近似種菊花滑刃線蟲(A. ritzemabosi)、草替 滑刃線蟲(A.打agariae)形態(tài)特征十分相似，開展形態(tài)鑒定需要扎實(shí)的分類功底，具有一 定的局限性。在分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的時(shí)代背景下，WPCR為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)在植 物寄生線蟲分類鑒定中日漸成熟。
[0004] 本研究W貝西滑刃線蟲核糖體28S rRNA-D2/D3區(qū)核酸序列為祀標(biāo)，設(shè)計(jì)其特異性 引物，同時(shí)引入核糖體ITS區(qū)通用引物作為內(nèi)標(biāo)，嘗試建立一種高效、穩(wěn)定地貝西滑刃線蟲 雙重PCR檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服貝西滑刃線蟲形態(tài)鑒定對(duì)技術(shù)人員素質(zhì)要求高 的難題，提供了一對(duì)新的貝西滑刃線蟲的特異性引物W及一種雙重PCR檢測方法，所述新的 貝西滑刃線蟲的特異性引物及雙重PCR檢測方法的步驟如下： 所述新的貝西滑刃線蟲的特異性引物，其特征在于，序列為：
上游引物GU-F: 下游引物GU-R: 所述新的貝西滑刃線蟲的特異性引物可與已報(bào)道的植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用引 物 F194: CGTAACAAGGTAGCTGTAG 和 AB28: ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT 組合建立雙重 PCR 檢測方 法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一、單條線蟲DNA的提??； 步驟二、雙重PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系巧0yL):10X PCR BuffeKlS mmol/L Mg2+)5 化， dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，兩對(duì)引物F194/ AB28和GU-F/GU-R(10 ymol/L)每條引物I yL(共 化Ujhq DNA聚合酶巧U/yL)0.4化，模板DNA 10化，雙蒸水28.6化。除引物外，所用試 劑均購自寶生物(TAKARA)公司。PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5 min;40個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 °C變 性30 sec,55 °C退火30 sec,72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫10 min,使反應(yīng)物充分延 伸； 步驟=、結(jié)果判定:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測若出現(xiàn)780 bp和245 bp兩個(gè)擴(kuò)增條帶，陰性 對(duì)照（雙蒸水)無擴(kuò)增條帶，則說明待檢線蟲為貝西滑刃線蟲，若只有780 bp擴(kuò)增條帶，無 245 bp擴(kuò)增條帶或出現(xiàn)大小不一致的條帶，則說明待檢線蟲不是貝西滑刃線蟲。
[0006] 所述雙蒸水即為經(jīng)過兩次蒸饋的無菌水，其通常用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0007] 所述裂解液中的IOX PCR Buffer為TAKARA公司生產(chǎn)，商品編號(hào)分別為ROOlB和 9033； 優(yōu)選地，本申請(qǐng)的貝西滑刃線蟲的雙重PCR檢測方法中，步驟二中PCR反應(yīng)條件要求退 火溫度為55 °C。
[000引本申請(qǐng)的方法適用于特異性檢測貝西滑刃線蟲(Aphelenchoides besseyi)。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于:新設(shè)計(jì)的貝西滑刃線蟲的特異性引物可與 已報(bào)道的植物寄生線蟲ITS區(qū)通用擴(kuò)增引物組合建立雙重PCR檢測方法，通過PCR擴(kuò)增快速 檢測貝西滑刃線蟲，克服了 W前形態(tài)鑒定對(duì)技術(shù)人員素質(zhì)要求高的難題。本發(fā)明中的方法 高效、穩(wěn)定，靈敏度達(dá)到1/10條線蟲DNA的水平，可在我國口岸及農(nóng)林部口檢疫鑒定中推廣 應(yīng)用。
【附圖說明】
[0010]圖1單重PCR檢現(xiàn)巧法特異性現(xiàn)聯(lián)結(jié)果； 圖2雙重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果； 圖3雙重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果； 圖1中各字母含義如下:M: DNA marker DL2000;泳道1-2: ABJS;泳道3-4: ABYN;泳道 5-6: AB皿；泳道7-8: ABT;泳道9-16: 27456、36890、22913、53121、26064、10967、1304、 1406;泳道17:雙蒸水陰性對(duì)照。
[00川圖2中各字母的含義如下：M: DNA marker DL2000;泳道1-2: ABJS;泳道3-4: ABYN;泳道 5-6: ABHB;泳道 7-8: ABT;泳道 9-16: 27456、36890、22913、53121、26064、 10967、1304、1406;泳道17:雙蒸水陰性對(duì)照。
[001^ 圖3中各字母含義如下:M: DNA marker DL2000;泳道1-8:分別為單條線蟲未稀 釋、稀釋5 X、稀釋IOX、稀釋20 X、稀釋40 X、稀釋80 X、稀釋160 X、稀釋320 X ;泳道9:雙 蒸水陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[001引為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，茲舉W下實(shí)施例，并配合附圖詳 細(xì)說明如下： 標(biāo)本來源 供試線蟲包括貝西滑刃線蟲、松材線蟲、擬松材線蟲等多種線蟲的12個(gè)群體，詳情見下 表： 表1供試線蟲來源
實(shí)施例1、單重PCR檢測方法特異性測試 1.單條線蟲DNA提取 用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含如L d地20的PCR管中，用小型解剖刀 將線蟲切為2-3段，瞬時(shí)離屯、，反復(fù)凍融2次(液氮處理Imin, 65°C水浴2min)后，加入化L裂解 液(所述裂解液為10 X PCR Buf f er、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1)，10 X PCR Buf fer與20mg/mL蛋白酶K均購自TAKARA公司），56°C保溫化，95°C加熱IOmin，瞬時(shí)離 屯、后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0014] 單重PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系50 化：線蟲DNA模板 10 yUlOX PCR Buffer(Mg2〇5 yL、dNTP 2 化、引 物(GU-F/GU-R)各 1 yLjTaq酶0.4 yL、d地2〇 30.6 化。PCR反應(yīng)程序：95 °C預(yù)變性5 min; 39個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 °C變性30 sec,55 °C退火30 sec,72 °C延伸1 min;最后72 °C保溫10 min，使反應(yīng)物充分延伸。
[001引電泳檢測 每個(gè)樣品取化L擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后 將凝膠放入邸染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0016] 單重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果 根據(jù)特異性引物GU-F/GU-R對(duì)貝西滑刃線蟲及其近似種的檢測結(jié)果表明（圖1)，該引物 對(duì)貝西滑刃線蟲擴(kuò)增獲得245 bp的特異性片段，其他線蟲群體與陰性對(duì)照(雙蒸水)則無條 帶出現(xiàn)，對(duì)特異性片段回收測序后，Blast比對(duì)證明PCR產(chǎn)物即為目的片段，說明新構(gòu)建的多 重PCR檢測方法滿足特異性要求。
[0017] 實(shí)施例2、雙重PCR檢測方法特異性測試 1.單條線蟲DNA提取 同實(shí)施例1。
[001引雙重PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系50 化：線蟲DNA模板 10 yUlOX PCR Buffer(Mg205 yL、dNTP 2 化、內(nèi) 標(biāo)引物F194/AB28各1化、特異性引物GU-F/GU-R各1 yLjTaq酶0.4 yL、d地20 28.6化。 PCR反應(yīng)程序:95 °C預(yù)變性5 min;39個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 °C變性30 sec,55 °C退火30 sec,72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫10 min 3.電泳檢測 同實(shí)施例1。
[0019] 雙重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果 在貝西滑刃線蟲特異性PCR反應(yīng)體系中，加入通用引物F194/AB28作為內(nèi)標(biāo)，構(gòu)建一步 雙重PCR檢測方法。結(jié)果表明（圖2)，貝西滑刃線蟲群體均擴(kuò)增出兩條清晰、穩(wěn)定的條帶，內(nèi) 標(biāo)引物擴(kuò)增產(chǎn)生780 bp的條帶，貝西滑刃線蟲特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生245 bp的條帶;而其他 線蟲群體只有內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增產(chǎn)生780 bp的條帶，無貝西滑刃線蟲特異性引物條帶出現(xiàn)，陰 性對(duì)照(雙蒸水)無條帶，說明雙重PCR檢測方法完全滿足特異性的要求。
[0020] 實(shí)施例3、雙重PCR檢測方法靈敏度測試 1.單條線蟲DNA提取 同實(shí)施例1。
[0021] 雙重PCR擴(kuò)增 同實(shí)施例2。
[0022] 電泳檢測 同實(shí)施例1。
[0023] 雙重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果 W單條線蟲DNA未稀釋、5 X稀釋、10 X稀釋、20 X稀釋、40 X稀釋、80 X稀釋、160 X稀 釋、320 X稀釋為梯度濃度的靈敏度測試結(jié)果顯示，單條貝西滑刃線蟲DNA的特異性條帶清 晰、明亮，稀釋至IOX時(shí)，特異性產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)引物條帶均清晰可見，說明本研究建立的雙重 PCR檢測方法的靈敏度為1 /10條線蟲DNA，完全滿足靈敏度的要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一對(duì)用于貝西滑刃線蟲PCR檢測的特異性引物，其特征在于，序列為： 上游引物⑶-F: 5 二GACACTGCAATCGCTTCGAC-3、 下游引物⑶-R: 5 二ATCCGCAACCACAACTCACA-3 \2. 根據(jù)權(quán)利要求1的特異性引物，其特征在于，該特異性引物可與已報(bào)道的植物寄生線 蟲核糖體 ITS區(qū)通用引物F194 : 5、CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3 L28 : 5、 ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-31且合建立雙重PCR檢測方法，該方法包括如下步驟： 步驟一、單條線蟲DNA的提??； 步驟二、多重PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系（50yL):10X PCR Buffer(15 mmol/L Mg2+)5 yL， dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，兩對(duì)引物F194/ AB28和⑶-F/GU-R(10 ymol/L)每條引物 1 yL(共 ^iLhrTaq DNA聚合酶(5 υ/μυ〇·4 yL，模板DNA 10 yL，雙蒸水28.6 yL;除引物外，所用試 劑均購自寶生物(TAKARA)公司；PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5 min;40個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 °C變 性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫10 min，使反應(yīng)物充分延 伸； 步驟三、結(jié)果判定:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測若出現(xiàn)780 bp和245 bp兩個(gè)擴(kuò)增條帶，陰性 對(duì)照（雙蒸水)無擴(kuò)增條帶，則說明待檢線蟲為貝西滑刃線蟲，若只有780 bp擴(kuò)增條帶，無 245 bp擴(kuò)增條帶或出現(xiàn)大小不一致的條帶，則說明待檢線蟲不是貝西滑刃線蟲。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的檢測方法，其特征在于，步驟二的PCR反應(yīng)條件中，退火溫度為55 Γ。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的特異性引物和權(quán)利要求2的檢測方法，其特征在于:所述雙重PCR檢 測方法系用于特異性檢測貝西滑刃線蟲。
【專利摘要】本發(fā)明提供了1對(duì)用于貝西滑刃線蟲PCR檢測的特異性引物及其使用方法，所述方法的關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)為新設(shè)計(jì)的貝西滑刃線蟲的特異性引物可與已報(bào)道的植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用引物組合建立一種新的雙重PCR檢測方法，用于快速鑒定貝西滑刃線蟲。本發(fā)明中的方法高效、穩(wěn)定，靈敏度達(dá)到1/10條線蟲DNA的水平，可在我國口岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定中推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105603060
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510900774
【發(fā)明人】林宇, 王金成, 張?jiān)＞? 劉躍庭, 馮潔, 顧建鋒, 陳先鋒
【申請(qǐng)人】天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心
【公開日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2015年12月9日