肉鴨otxr基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及W肉鴨的功能基因的單核巧酸多態(tài)性(SNP)作 為分子遺傳標(biāo)記，特別設(shè)及肉鴨OTXR基因的單核巧酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核巧酸(A/T/C/G)的替換 而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNP包括堿基的替換、插入、缺失W及重復(fù)序列拷貝數(shù)的 變化。一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核巧酸的變化，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者 顛換所引起;具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核巧酸的 胞喀晚是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形 成胸腺喀晚。
[0003] 在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNP，根據(jù)它們?cè)诨?組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNP (CSNP )、基因周邊SNP (pSNP)和基因間SNP (i SNP)等 S類。總的說來，CSNP比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的1/5,但它在遺傳病 和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對(duì)遺傳性狀的影響，CSNP又可分為兩 種：一種是同義cSNP，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序 列，突變堿基與未突變堿基的"含義"相同；另一種是非同義cSNP，即堿基序列的改變將導(dǎo)致 編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對(duì) 編碼區(qū)SNP的非同義突變來說，它們可能對(duì)基因功能有直接的重要影響。不僅如此，在群體 遺傳研究中，運(yùn)些SNP作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。
[0004] 由于SNP是二等位基因分子標(biāo)記，所W，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNP可能 是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNP很罕見，故SNP通常被 簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNP:即DNA序列測(cè) 定方法、PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核巧酸連接反應(yīng)等。在運(yùn) 些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴， 且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所 W，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與 DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可W適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長，操作比 較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陽性問題，所W，也并非理想的SNP檢測(cè)手段;AS-PCR方法作為 一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè) 計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過程中還存在誤檢的概率，因此，目 前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn);而引物延伸法和寡核巧酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板 讀數(shù)儀、基因忍片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來說可實(shí)施 性不強(qiáng)。
[000引PCR-RFLP方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后使用限制性內(nèi)切酶進(jìn) 行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙締凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。PCR-RFLP方法 不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了其費(fèi)用昂貴、操作繁瑣、假陽性率高的缺點(diǎn)，而且所 檢測(cè)的序列位點(diǎn)無特殊性要求。
[0006] OXTRWwtocin receptor)是一種由389個(gè)氨基酸組成的G蛋白偶聯(lián)受體，由7個(gè)跨 膜區(qū)域組成，通過與G蛋白偶聯(lián)，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)外巧離子和甘油二醋濃度的變化，影響神經(jīng)元 細(xì)胞的興奮性及其他生物學(xué)效應(yīng)。已有的研究表明OXTR與能量代謝(食物攝入和能量消耗） 相關(guān)。Takayanagi等發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素受體缺失的雄性小鼠（0XTR-/-)表現(xiàn)出遲發(fā)性肥胖Qate-onset obesity),比如腹部脂肪增加和空腹甘油S醋的增加都比較慢。OXTR-/-小鼠與野生 型小鼠相比，每日食物攝入量和自發(fā)性運(yùn)動(dòng)沒有顯著差別。相反，OXTR-/-小鼠的棟色脂肪 組織中含有大量的脂滴，導(dǎo)致產(chǎn)熱受損。運(yùn)項(xiàng)研究表明，OXTR在調(diào)節(jié)能量平衡中起著重要作 用。因此，研究家禽OTXR基因遺傳變異和分子遺傳特征具有重要理論和實(shí)踐意義。
[0007] 國內(nèi)外關(guān)于OTXR基因遺傳變異的研究多見于人、鼠等動(dòng)物，而未見肉鴨OTXR基因 遺傳變異或SNP研究的報(bào)道。由于目前肉鴨OTXR基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匿乏，使該基因位 點(diǎn)的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的研究成為空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明解決的問題在于提供肉鴨OTXR基因單核巧酸多態(tài)性檢測(cè)方法及其應(yīng)用，尋 找與肉鴨經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，加快肉鴨良種繁育速度。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供肉鴨OTXR基因的單核巧酸多態(tài)性，該基因單核巧酸多態(tài)性 包括：肉鴨OTXR基因外顯子2第946位為T或C的單核巧酸多態(tài)性。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供肉鴨OTXR基因的單核巧酸多態(tài)性的檢巧巧法，W包含 OTXR基因的待測(cè)肉鴨全基因組DNA為模板，W引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增肉鴨OTXR基因；用限 審雌內(nèi)切酶PstI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳;根據(jù) 電泳結(jié)果鑒定肉鴨OTXR基因外顯子2第946位的單核巧酸多態(tài)性；
[001。 所述的引物對(duì)P為：
[0012] 上游引物Pl :5' -GCTTCACGCAGCCTGCAG-3'
[0013] 下游引物口2:5'-166押(：口'60：01；67^-3'。
[0014] 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[001 引 94°(：預(yù)變性5111111;94°(：變性303,54.6°(：退火303,72°(：延伸303,35個(gè)循環(huán)；72°(：延 伸lOmin。
[0016] 所述的瓊脂糖凝膠為質(zhì)量濃度為2.5%的瓊脂糖。
[0017] 所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，OTXR基因外顯子2第946位的堿基多態(tài)性為:TT 型為1個(gè)片段：179bp; CC型為2個(gè)片段：17bp和19化P; CT型為3個(gè)片段：17bp、179bp和196bp。 由于片段17bp太小，在瓊脂糖凝膠不能觀察到，所W在瓊脂糖凝膠上，TT基因型可W觀察到 1條帶（179bp);CC基因型可W觀察到1條帶（196bp)，CT基因型可W觀察到2條帶（179bp和 19 化 P)。
[0018] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供肉鴨OTXR基因的單核巧酸多態(tài)性的檢測(cè)方法在優(yōu) 化肉鴨個(gè)體育種繁殖中的應(yīng)用。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果：
[0020] 本發(fā)明公開了與肉鴨生長發(fā)育相關(guān)的功能基因 OTXR的核巧酸多態(tài)性，該核巧酸多 態(tài)性能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì) 肉鴨個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。
[0021 ] 本發(fā)明對(duì)肉鴨OTXR基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，結(jié)果顯示OTXR基 因的核巧酸多態(tài)位點(diǎn)能夠成為分子遺傳輔助育種的標(biāo)記。
[0022] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為肉鴨OTXR基因的SNP與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系的建立奠定了基 礎(chǔ)，W便用于肉鴨標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的肉鴨種群。
【附圖說明】
[0023] 圖1為肉鴨OT邸基因外顯子2的19化P克隆測(cè)序PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0024] 圖2為肉鴨OTXR基因外顯子2的196bp PCR產(chǎn)物的PstI酶切電泳檢測(cè)OTXR基因多態(tài) 性的電泳結(jié)果圖；泳道1: CT基因型個(gè)體（179bp和196bp);泳道2: TT基因型個(gè)體（179bp);泳 道3、4:CC基因型個(gè)體（196bp);M:Marker(2000bp);由于片段17bp太小，在瓊脂糖凝膠不能 觀察到，所W在瓊脂糖凝膠上，TT基因型可W觀察到1條帶（179bp);CC基因型可W觀察到1 條帶（196bp)，CT基因型可W觀察到2條帶（179bp和19化P)。
[0025] 圖3為肉鴨OTXR基因 SNP的不同基因型測(cè)序峰圖，其中圖3中由上至下S張圖分別 代表CT、IT和CC基因型。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明WOTXR基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增OTXR基因外顯子2的的196bp片段，W北 京鴨的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)測(cè)序后尋找該擴(kuò)增片段的單 核巧酸多態(tài);針對(duì)發(fā)現(xiàn)的單核巧酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測(cè)方法，使得OTXR 基因的核巧酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測(cè)的分子遺傳標(biāo)記，為加快建立具有優(yōu)質(zhì) 經(jīng)濟(jì)性狀的肉鴨種群提供依據(jù)。
[0027] a、肉鴨OT邸基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測(cè) [002引1、肉鴨血樣的采集及處理
[0029] 取北京鴨血樣6mL，加入0.5mol/L的抗凝劑ACD ImL抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰 盒，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 本發(fā)明采用北京鴨樣品，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，共隨機(jī)采 樣188只。
[0031 ] 2、血樣基因組DNA的提取、純化
[003引 （1)取20化抗凝全血置于1. SmL的離屯、管中，再添加500化1 X STE緩沖液、1扣 L20 % SDS和20化0.01 mg/化蛋白酶K，置于55 °C水浴鍋中，過夜消化。
[0033] (2)將離屯、管取出，添加500化飽和酪，于冰盒中輕搖20min，離屯、IOmin(1000 Or/ min) O
[0034] (3)取上清，放到新的離屯、管中（無菌），加入50化L飽和酪，于冰盒中輕搖20min，離 屯、IOmin(lOOOOr/min)。
[0035] (4)取上清，移入新的滅過菌的離屯、管中，加入50化L氯仿-異戊醇(氯仿-異戊醇體 積比24:1)，于冰盒中輕搖2〇111；[]1，離屯、1〇111；[]1(1000〇1'/111；[]1)。
[0036] (5)取上清，移到無菌的新的離屯、管中，加入ImL冰無水乙醇（-20°C)，來回顛倒沉 淀物(0臟），離屯、10111111(10000以111111)，輕輕倒掉上清液。
[0037] (6)加入ImL 70%乙醇，清洗DM,lOOOOr/min離屯、5min，棄上清液。
[003引（7)重復(fù)步驟6。
[0039] (8)置于通風(fēng)楓中，干燥2~地，使其水分揮發(fā)。
[0040] (9 )DNA完全干燥后，加入200化滅菌后的TE溶液，在4°C冰箱中放置3天，W溶解 DNA。
[0041] (10)將提取到的DNA短期(-20°c)或長期(-70°c)保存，使用前取出稀釋即可。
[0042] 3、DNA池的構(gòu)建
[0043] (1) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
[0044] 選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解 的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。
[004引（2)0D值測(cè)定
[0046] 用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和0D260/ 0D280的比值。如0D260/0D280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酪，則應(yīng)進(jìn)行 純化;若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。
[0047] DNA濃度(yg/mU =50 X0D26日值X稀釋倍數(shù) [004引 （3)肉鴨DNA池的構(gòu)建
[0049] DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至SOmgAiL,然后從50個(gè)