一種丙氨環(huán)丙沙星半抗原及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)丙沙星抗原的制備方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)丙沙星(Cipr〇fl〇Xacin，CIP)屬于第三代氟喹諾酮類藥物，是一種常用廣譜抗 生素類藥物，常作為抗菌劑廣泛地應(yīng)用于畜禽細(xì)菌性傳染病的預(yù)防及治療。但過(guò)量使用或 濫用可導(dǎo)致該藥物在動(dòng)物源性食品中殘留，從而對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的威脅。因此世界各 國(guó)對(duì)環(huán)丙沙星以及其他氟喹諾酮類藥物的的殘留限量越來(lái)越嚴(yán)格，我國(guó)農(nóng)業(yè)部最新修訂的 《動(dòng)物性中食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定牛、羊等的奶中及所有食品動(dòng)物的肌肉、脂肪、 肝、腎臟中所有環(huán)丙沙星藥物的最高殘留限量lOOppb。目前，應(yīng)用于環(huán)丙沙星與其他喹諾酮 類藥物檢測(cè)的常用方法有高效液相色譜(HPLC)、GC/MS、LC/MS與ELISA。免疫分析具有靈敏、 快速、操作簡(jiǎn)單、特異性高的特點(diǎn)，在高通量藥物殘留篩選技術(shù)領(lǐng)域占據(jù)極為重要的地位。 而免疫分析方法過(guò)程中，抗原的制備又是最為關(guān)鍵的一個(gè)步驟。
[0003] 由于環(huán)丙沙星分子量較小，必須將其與載體偶聯(lián)形成完全抗原后才能制備相應(yīng)抗 體，因此，合成高質(zhì)量的免疫原是小分子物質(zhì)免疫分析的關(guān)鍵。合成免疫原一般采用化學(xué)方 法使半抗原與載體蛋白偶聯(lián)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了式（I)所示的丙氨環(huán)丙沙星化合物、其制備方法、以及式（I)化合物 作為半抗原/中間體，以用于制備環(huán)丙沙星包被抗原的用途和方法。
[0005]
[0006] 具體公升J式（1)化合物的制爸萬(wàn)法包谷以卜步驟：
[0007] (1)取鹽酸環(huán)丙沙星0.33g，溶于1 OmlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，80 °C攪拌；
[0008] (2)逐滴加入氫溴酸3-溴丙氨0.26g，80°C攪拌3h;
[0009] (3)將步驟(2)制備得到的反應(yīng)液減壓蒸餾，得到式(I)化合物。
[0010] 以及進(jìn)一步的，通過(guò)制備液相色譜對(duì)式(I)進(jìn)行純化的方法;其中制備液相色譜的 色譜條件為色譜柱尺寸為150_ X 4.6mm，色譜柱的固定相填充顆粒的粒徑為3.5um;流動(dòng)相 流速 1 .OmL/min，柱溫40°C ;
[0011] 所述制備色譜色譜的流動(dòng)相為乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液：以體積百分比 計(jì)，1 - 9分鐘為5 % -95 %的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，9 -14分鐘為95 %的乙腈的 三氟乙酸水溶液，14-15分鐘為95% - 5%的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，其中所述 三氟乙酸水溶液為含體積濃度0.01 %的三氟乙酸的水溶液；收集制備液相色譜柱的流出 液，得純化的式(I)化合物。
[0012] 本發(fā)明公開了式（I)化合物用于制備環(huán)丙沙星包被抗原的用途，即作為制備環(huán)丙 沙星包被抗原的中間體，或者作為制備環(huán)丙沙星包被抗原的半抗原，以制備環(huán)丙沙星-丙 氨-牛血清蛋白、環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白的用途。
[0013] 具體的，本發(fā)明所述的式(I)化合物制備環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白或環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白抗原的用途，在于所述制備方法包含以下步驟：
[0014] (1)取式（I)化合物0 · 10g，溶于5mL 0 ·6mol/L的鹽酸溶液中，加入30mg鋅粉，80°C 水浴鍋加熱30min，得溶液A;
[0015] ⑵稱取1 〇〇mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mo 1/L的磷酸鹽緩沖液中，得溶液B;
[0016] (3)將溶液A緩慢滴加到溶液B中充分混合，滴加體積濃度25 %的戊二醛水溶液 0. lml，室溫?cái)嚢?小時(shí)；混合液裝入透析袋，PH值7.4的0 . Olmol/L的磷酸鹽緩沖液液4°C透 析72小時(shí)，得環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。
[0017] 同時(shí)，本發(fā)明提供了一種制備環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白的方法，包含以下步驟：
[0018] (1)取式（I)化合物0 · 10g，溶于5mL 0 ·6mol/L的鹽酸溶液中，加入30mg鋅粉，80°C 水浴鍋加熱30min，得溶液A;
[0019 ] ⑵稱取1 〇〇mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mo 1/L的磷酸鹽緩沖液中，得溶液B;
[0020] (3)將溶液A緩慢滴加到溶液B中充分混合，滴加體積濃度25 %的戊二醛水溶液 0. lml，室溫?cái)嚢?小時(shí)；混合液裝入透析袋，PH值7.4的0.01m〇l/L的磷酸鹽緩沖液液4°C透 析72小時(shí)，得環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。
[0021] 進(jìn)一步的，本發(fā)明公開了上述制備方法得到的環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白產(chǎn)品， 及環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白包被抗原；以及以所述環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白作為抗原免 疫新西蘭兔制備環(huán)丙沙星抗體、進(jìn)而制備環(huán)丙沙星檢測(cè)試劑盒的用途。
[0022] 此外，本發(fā)明還具體的提供了所述的式（I)化合物制備環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白 或環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原的用途，在于所述制備方法包含以下步驟：
[0023 ] (1)式（I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C;
[0024] (2)取1-(3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽30mg，溶于4mL蒸餾水，緩慢滴 加至溶液C中，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，得溶液D;
[0025] (3)將步驟(2)制備的溶液D離心，取上清液，緩慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳 酸鈉緩沖水溶液中，所述碳酸鈉緩沖水溶液的濃度為〇. lmol/L，4°C攪拌72小時(shí)，得環(huán)丙沙 星-丙氨-卵清蛋白。
[0026] 同時(shí)，本發(fā)明提供了一種制備環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白的制備方法，包含以下步 驟：
[0027] (1)式（I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C;
[0028] (2)取1-(3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽30mg，溶于4mL蒸餾水，緩慢滴 加至溶液C中，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，得溶液D;
[0029] (3)將步驟(2)制備的溶液D離心，取上清液，緩慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳 酸鈉緩沖水溶液中，所述碳酸鈉緩沖水溶液的濃度為〇. lmol/L，4°C攪拌72小時(shí)，得環(huán)丙沙 星-丙氨-卵清蛋白。
[0030] 進(jìn)一步的，本發(fā)明公開了上述制備方法得到的環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白，或作為 環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原和環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白包被抗原；以及以所述環(huán)丙沙 星-丙氨-卵清蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備環(huán)丙沙星抗體，進(jìn)而制備環(huán)丙沙星檢測(cè)試劑 盒的用途。
[0031] 本發(fā)明合成了丙氨環(huán)丙沙星半抗原，經(jīng)過(guò)ESI-MS、IR和1H-NMR與 13C-匪R對(duì)合成的 半抗原進(jìn)行了確證，為進(jìn)一步建立的ELISA檢測(cè)方法提供了必要的半抗原結(jié)構(gòu)信息。該半抗 原可利用其遠(yuǎn)離抗原決定簇結(jié)合位點(diǎn)的-NH 2與蛋白載體上氨基的偶聯(lián)，制備出理想的人工 抗原。
[0032] 同時(shí)，本發(fā)明合成了環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原，以及環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清 蛋白抗原，并通過(guò)紫外吸收光譜法鑒定了結(jié)構(gòu)?？蓪⒈景l(fā)明制備的人工抗原免疫新西蘭白 兔，獲得環(huán)丙沙星抗體，以制備環(huán)丙沙星檢測(cè)試劑盒。
[0033]抗體通常對(duì)遠(yuǎn)離聯(lián)結(jié)位點(diǎn)的半抗原部分具有較好的識(shí)別能力，因此半抗原與載體 蛋白的偶聯(lián)位置最好遠(yuǎn)離重要的抗原決定簇。環(huán)丙沙星母環(huán)上的6位F原子、4位羰基和3位 羧基官能團(tuán)是抗體識(shí)別過(guò)程中起重要作用的部分，在哌嗪環(huán)上鏈接一個(gè)側(cè)鏈，使偶聯(lián)位置 遠(yuǎn)離抗原決定簇有利于獲得效價(jià)高、特異性好的抗體。因此，在制備環(huán)丙沙星免疫原的過(guò)程 中，我們保留了環(huán)丙沙星的的6位F原子、4位羰基和3位羧基官能團(tuán)。本發(fā)明通過(guò)在遠(yuǎn)離6位 F、4位羰基和3位羧基官能團(tuán)的哌嗪環(huán)位點(diǎn)鏈接一個(gè)側(cè)臂(又稱間隔臂)后得到半抗原后，再 制備環(huán)丙沙星抗原。
[0034]包被抗原中的半抗原和蛋白載體(BSA、0SA等）間的間隔臂長(zhǎng)度對(duì)特異性抗體的產(chǎn) 生有較大影響，選擇適當(dāng)?shù)拈g隔臂可進(jìn)一步促進(jìn)免疫系統(tǒng)對(duì)半抗原部分的識(shí)別，進(jìn)而產(chǎn)生 更高特異性的抗體。本發(fā)明的合成包被原，由于選擇了恰當(dāng)?shù)拈g隔臂形式(丙氨）制備得到 了半抗原，以及采用特定的制備包被抗原的方法，這與直接使用環(huán)丙沙星制備得到的包被 抗原、以及與環(huán)丙沙星其他形式的半抗原制備得到的包被抗原相比，經(jīng)過(guò)免疫新西蘭兔，得 到了專屬性和靈敏度更高的抗血清和抗體，顯著提高了ELISA檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度。 [0035] 說(shuō)明書【附圖說(shuō)明】：
[0036]圖1丙氨環(huán)丙沙星的紅外光譜
[0037]圖2:丙氨環(huán)丙沙星的電噴霧質(zhì)譜圖譜(ESI-MS)
[0038]圖3:丙氨環(huán)丙沙星的碎片m/z389的電噴霧質(zhì)譜圖譜(ESI-MS)
[0039] 圖4丙氨環(huán)丙沙星的1H-核磁共振圖譜PH-NMR)
[0040] 圖5丙氨環(huán)丙沙星的13c-核磁共振圖譜(I3c--NMR)
[0041] 圖6:環(huán)丙沙星-丙氨、環(huán)丙沙星-丙氨-牛血清蛋白、牛血清蛋白的紫外吸收光譜
[0042] 圖7:環(huán)丙沙星-丙氨、環(huán)丙沙星-丙氨-卵清蛋白、卵清蛋白的紫外吸收光譜 [0043]以下為【具體實(shí)施方式】
[0044]實(shí)施例1、丙氨環(huán)丙沙星的制備
[0045] 取鹽酸環(huán)丙沙星0.33g(lmmol)，溶于lOmlDMF溶液中，80°C攪拌溶解，逐滴加入氫 溴酸3-溴丙氨0.26g(l.2mmol)，80°