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IL-12/CD107a融合蛋白增強(qiáng)CTL抗腫瘤效果的治療劑及其制法和用圖

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IL-12/CD107a融合蛋白增強(qiáng)CTL抗腫瘤效果的治療劑及其制法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,具體地涉及一種基于IL-12膜迀移瞬時(shí)表達(dá)的高效低毒的 腫瘤治療劑及其制法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] IL-12是一種非常重要的免疫刺激因子。IL-12是由共價(jià)鍵鏈接的異質(zhì)性二聚體細(xì) 胞因子,由P35和p40亞基組成,在體內(nèi)由激活的免疫細(xì)胞分泌。IL-12是重要的細(xì)胞免疫調(diào) 控因子,在抗感染免疫及惡性腫瘤的免疫中通過(guò)NK細(xì)胞以及CTL發(fā)揮作用。
[0003] 雖然IL-12具有顯著的抑瘤效果,但是由于其系統(tǒng)性全身給藥會(huì)引起全身性毒副 反應(yīng),因而受到極大的限制。在本發(fā)明之前,IL-12的臨床應(yīng)用由于其所誘導(dǎo)的全身性毒副 作用,以及早期臨床試驗(yàn)通過(guò)全身系統(tǒng)性給藥引起的兩例患者的意外死亡,使其臨床應(yīng)用 受到大大的限制。
[0004] 為了避免全身性給藥的毒副作用從而實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的目的,臨床科研工作者們通 過(guò)腫瘤局部注射、瞬時(shí)表達(dá)及多點(diǎn)注射等途徑應(yīng)用于腫瘤的臨床試驗(yàn),但是由于IL-12的治 療效果同回輸?shù)腎L-12的劑量直接相關(guān),上述局部的臨床方案并未有取得顯著的抑瘤效果。
[0005] 為了解決這一問(wèn)題,本發(fā)明人曾經(jīng)試圖通過(guò)基因修飾抗腫瘤T細(xì)胞持續(xù)分泌IL-12 來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果的最大化,但是由于未知的原因(一種可能的原因是IL-12的毒副作用) 通過(guò)持續(xù)分泌IL-12方案基因修飾的T細(xì)胞在體外不能有效擴(kuò)增,并引起大量的T細(xì)胞凋亡。 [0006]腫瘤已經(jīng)成為超越心血管疾病危害人類健康的第一殺手,本領(lǐng)域尚缺乏高效且低 毒副作用的基于IL-12的抗腫瘤藥物。因此,本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)高效且低毒副作用的腫瘤 治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是提供了一種高效且毒副作用低的腫瘤治療藥物及其制法和應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明構(gòu)建了一系列IL-12/CD107a的融合蛋白,包括IL-12的全序列(包括IL-12 的分泌片段),及在IL-12的C-端與⑶107a的N-端加入一個(gè)鏈接肽段(SGSG)分別同⑶107a 的全長(zhǎng)序列及去掉分泌肽的CD107a連接的分子策略。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,上述兩種融合蛋白基 因修飾抗腫瘤CTL后,可以增強(qiáng)體內(nèi)外的抗腫瘤反應(yīng),其中無(wú)分泌肽的CD107a融合蛋白不但 可以顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存,同時(shí)對(duì)基因修飾的抗腫瘤T細(xì)胞的體外擴(kuò)增沒(méi)有明顯的毒副 作用,是一種非常有臨床應(yīng)用前景的抗腫瘤增效方案。
[0009] 應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1.抗腫瘤CTL表達(dá)融合蛋白hscIL-12/CD107a的增效分子機(jī)制示意圖。CD107a (又稱為L(zhǎng)AMP1)是一種表達(dá)于溶酶體上的跨膜蛋白,它的N-端位于溶酶體腔囊一側(cè),C-端是 一小段肽段,朝向胞漿一側(cè),當(dāng)抗腫瘤T細(xì)胞在識(shí)別腫瘤抗原時(shí),溶酶體與T細(xì)胞膜融合而發(fā) 生T細(xì)胞或NK細(xì)胞的脫顆粒效應(yīng),即T細(xì)胞或NK細(xì)胞釋放效應(yīng)分子顆粒酶(Granzyme B)及穿 孔素(perforin)而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程。在T細(xì)胞與腫瘤T細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的時(shí),CD107a 迀移到T細(xì)胞膜上的特性已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于反映 T細(xì)胞殺傷功能的一個(gè)指標(biāo)。如圖左側(cè)所 示,當(dāng)抗腫瘤T細(xì)胞識(shí)別腫瘤的同時(shí),T細(xì)胞內(nèi)的溶酶體向胞膜一側(cè)迀移并融合,CD107a分子 暴露于細(xì)胞膜外,并可以檢測(cè),標(biāo)示為CD107a陽(yáng)性細(xì)胞。如圖右側(cè)所示,為了實(shí)現(xiàn)IL-12的溶 酶體囊內(nèi)表達(dá),本發(fā)明構(gòu)建了一系列IL-12/⑶107a的融合蛋白,包括IL-12的全序列(包括 IL-12的分泌片段)及在IL-12的C-端與⑶107a的N-端加入一個(gè)鏈接肽段分別與全長(zhǎng)的 ⑶107a分子及去除分泌肽段的⑶107a分子融合,當(dāng)T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞時(shí),IL-12分子通過(guò) CD107a迀移到T細(xì)胞膜表面,實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的增效反應(yīng)。
[0011] 圖2.hscIL-12/⑶107a融合蛋白系列的構(gòu)建及轉(zhuǎn)導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞介導(dǎo)的表達(dá)。A.慢 病毒表達(dá)IL-12/CD107a融合蛋白系列載體的構(gòu)建。通過(guò)第三代慢病毒載體表達(dá)融合蛋白, 所選用的啟動(dòng)子為MSCV及EF-la,已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于人體的腫瘤免疫細(xì)胞治療,具有表達(dá) 的穩(wěn)定性及安全性,表達(dá)基因構(gòu)件可以替代為需要表達(dá)的基因,即MART-1TCR以及IL-12/ 0)107a融合蛋白系列等。該載體的5'及3'LTR( long terminal repeat)被改造成SIN-LTR (self-inactivating-LTR),目的是降低慢病毒重組的機(jī)率,增強(qiáng)安全性能,聯(lián)合WPRE終止 RNA轉(zhuǎn)錄的功能,是目前廣泛應(yīng)用于臨床的最新一代的基因工程載體結(jié)構(gòu)。B.T細(xì)胞的基因 修飾策略。T細(xì)胞活化后,通過(guò)兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)即MART-1TCR(第一天)及圖示中三個(gè)載體的序貫轉(zhuǎn) 導(dǎo)(第4天),于第14天,與表達(dá)MART-1識(shí)別靶點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞526、938共培養(yǎng)。C.抗腫瘤T細(xì)胞 膜表面IL-12分子的表達(dá)。共培養(yǎng)4小時(shí)后,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞膜表面hscIL-12的表 達(dá)。
[0012] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,細(xì)胞膜表面的IL-12只有在表達(dá)a-12/CD107a的融合蛋白組同表 達(dá)MART-1的MHC A2+反應(yīng)組中可以檢測(cè)出來(lái),分泌型的IL-12膜表面沒(méi)有表達(dá)。
[0013] 圖3.慢病毒載體表達(dá)hscIL-12/CD107a轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的增效反應(yīng)。如圖所示,T細(xì)胞 序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)抗腫瘤TCR及hscIL-12/CD107a融合蛋白系列14天后,與腫瘤細(xì)胞526及938共培 養(yǎng),16小時(shí)后,上清中IFN γ及IL-12表達(dá)水平通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)。同TCR基因修飾組比 較,序貫轉(zhuǎn)到融合蛋白組表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤增效反應(yīng),即分泌高水平的IFNy ;但是實(shí)驗(yàn) 上清中,只有C1組(持續(xù)分泌IL-12組)可以檢測(cè)到分泌的IL-12。*表示與對(duì)照組比較,p〈 0.001。
[0014] 圖4.慢病毒載體表達(dá)IL-12/⑶107a系列轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可以有效避免持續(xù)性分泌 IL-12造成的體外Τ細(xì)胞擴(kuò)增的毒副作用。Τ細(xì)胞序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)抗腫瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋 白系列14天后,各組細(xì)胞與對(duì)照轉(zhuǎn)導(dǎo)組(T-cell)的擴(kuò)增倍數(shù)比較,轉(zhuǎn)導(dǎo)持續(xù)分泌IL-12組較 其它各組的擴(kuò)增倍數(shù)顯著降低,*,Ρ〈〇.〇〇1。其中,轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-12/CD107a的C2組與轉(zhuǎn)到IL-12/ (no signal peptide)無(wú)分泌肽⑶107a的C3組比較,擴(kuò)增倍數(shù)顯著降低,**,Ρ〈0.01 <Χ3組與 TCR-T組比較,擴(kuò)增倍數(shù)接近,未見(jiàn)顯著差異。
[0015] 圖5.慢病毒載體hscIL-12/⑶107a系列轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞回輸治療顯著延 長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存。雌性pme 1小鼠(每組7只小鼠)通過(guò)B16F10細(xì)胞(5000細(xì)胞八鼠)植入顱內(nèi) (IC) 5天,細(xì)胞回輸前1天小鼠接受5 G y全身放療。鼠的T細(xì)胞取自小鼠的脾臟細(xì)胞,通過(guò) 10ug/ml的刀豆蛋白(Con A)在IL-2(5IU/ml)存在的條件下活化;第2天,用圖示中慢病毒載 體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)6天,收集細(xì)胞,通過(guò)小鼠尾靜脈注射(IV) 5X 106個(gè)T細(xì)胞。星號(hào) (*)表示該實(shí)驗(yàn)組與其它組比較,P〈〇.〇〇l;其中C3組與C2組比較(**),C3組的存活天數(shù)顯著 延長(zhǎng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P〈〇. 05。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究,首次開(kāi)發(fā)了一種結(jié)構(gòu)新穎的、具有高效殺傷腫 瘤細(xì)胞活性且毒副作用很小的IL-12融合蛋白。該IL-12/CD107a或IL-12/缺失分泌肽的 CD107a融合蛋白通過(guò)基因修飾抗腫瘤T細(xì)胞后,IL-12存在于細(xì)胞漿的溶酶體內(nèi),細(xì)胞膜表 面不能檢測(cè)到表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)本發(fā)明融合蛋白在T細(xì)胞中表達(dá)后,只有在抗腫瘤CTL識(shí)別 殺傷腫瘤時(shí)會(huì)瞬時(shí)有效展示在T細(xì)胞的表面。出乎意料的是,該IL-12/缺失分泌肽CD107a融 合蛋白系列對(duì)T細(xì)胞的活力(viability)基本無(wú)影響,并且攜帶本發(fā)明融合蛋白的抗腫瘤T 細(xì)胞在接近腫瘤細(xì)胞時(shí),IL-12才會(huì)瞬時(shí)表達(dá)在細(xì)胞膜表面,導(dǎo)致位于細(xì)胞膜表面IL-12更 有效而安全地作用于腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明中,通過(guò)T細(xì)胞攻擊腫瘤的局部并通過(guò)細(xì)胞表面瞬 時(shí)迀移的IL-12改變T細(xì)胞-腫瘤組織的免疫微環(huán)境,從而協(xié)同而有效地實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫效 果的最大化,同時(shí)極其顯著地降低IL-12的毒副作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0017] 具體地,本發(fā)明人利用通過(guò)CD107a表達(dá)IL-12,開(kāi)發(fā)了一種IL12/缺失分泌CD107a 的全新的融合蛋白,并通過(guò)慢病毒基因修飾抗腫瘤T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),顯示IL12/缺失分泌肽 CD107a慢病毒基因修飾抗腫瘤T細(xì)胞后,在抗腫瘤CTL識(shí)別腫瘤時(shí)瞬時(shí)表達(dá)于T細(xì)胞表面,對(duì) 腫瘤抗原的反應(yīng)表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫反應(yīng)的效應(yīng)。臨床前荷瘤鼠模型顯示,該方案修飾的T細(xì)胞 可以顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。換言之,瞬時(shí)膜表達(dá)所述融 合蛋白的T細(xì)胞一方面可有效地殺滅腫瘤細(xì)胞,另一方面經(jīng)證實(shí)具有體內(nèi)外的安全性。此 外,所述經(jīng)修飾的T細(xì)胞自身似乎僅受到所表達(dá)IL-12輕微的不利影響或基本上不受其影響 (與持續(xù)分泌IL-12的T細(xì)胞比較,本發(fā)明融合蛋白對(duì)T細(xì)胞的體外擴(kuò)增無(wú)明顯影響)。
[0018] 術(shù)語(yǔ)
[0019]如本文所用,術(shù)語(yǔ)"頭部"指多肽或其片段的N端,尤其是野生型多肽或其片段的N 端。
[0020] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"尾部"指多肽或其片段的C端,尤其是野生型多肽或其片段的C 端。
[0021] 如本文所用,所述的"含有","具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構(gòu)成"、 "基本上由……構(gòu)成"、和"由……構(gòu)成";"主要由……構(gòu)成"、"基本上由……構(gòu)成"和 "由……構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0022] ⑶107a又稱為L(zhǎng)AMP1,是一種表達(dá)于溶酶體上的跨膜蛋白,它的N-端位于溶酶體腔 囊一側(cè),(Eskelinen 2006)C-端是一小段肽段,朝向胞楽;一側(cè),當(dāng)抗腫瘤T細(xì)胞在識(shí)別腫瘤 抗原時(shí),溶酶體與T細(xì)胞膜融合而發(fā)生T細(xì)胞或NK細(xì)胞的脫顆粒效應(yīng),即T細(xì)胞或NK細(xì)胞釋放 效應(yīng)分子顆粒酶(Granzyme B)及穿孔素(perforin)而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程。在T細(xì)胞 與腫瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的時(shí),CD107a迀移到T細(xì)胞膜上的特性已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于反應(yīng)T細(xì)胞 殺傷功能的一個(gè)指標(biāo)。
[0023]
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