一種凝集素蛋白寡聚復(fù)合體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種凝集素蛋白寡聚復(fù)合體的構(gòu)建方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝集素是生物體中能夠與糖鏈物質(zhì)特異性識(shí)別并結(jié)合的一類蛋白質(zhì)分子。在生物 體中，凝集素的功能涉及細(xì)胞與細(xì)胞間的識(shí)別與交流，細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，病原體的侵染及其 與宿主間的相互作用，疾病的發(fā)生及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等方面。凝集素在醫(yī)學(xué)上被廣泛用于 抗病毒藥物的研發(fā)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，也可被用作抵抗病蟲害的生物制劑等。
[0003] 在病毒侵染宿主過程中，病毒糖蛋白與宿主細(xì)胞受體蛋白間的識(shí)別與互作是介導(dǎo) 病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的第一步。研究表明，一些凝集素分子能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合病毒表面的糖蛋 白，而減少和抑制其與宿主細(xì)胞表面受體蛋白間的結(jié)合，從而阻止病毒侵染宿主細(xì)胞。凝集 素與病毒糖蛋白間的結(jié)合效力越強(qiáng)，對(duì)病毒侵染宿主細(xì)胞的抑制能力也就越強(qiáng)，而凝集素 與糖蛋白間的結(jié)合效力與凝集素分子上具有的糖鏈結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相關(guān)，即糖鏈結(jié)合位點(diǎn)數(shù)越 多，其結(jié)合糖蛋白的能力也越強(qiáng)。
[0004] 此前已有研究發(fā)現(xiàn)來自于Microcystis aeruginosa的凝集素 microvirin(MVN)具 有較強(qiáng)的抵抗艾滋病病毒(HI V)侵染的能力，MVN可以特異性的結(jié)合含甘露糖結(jié)構(gòu)的糖鏈， 且該凝集素單體蛋白上僅有一個(gè)糖鏈結(jié)合位點(diǎn)，因此，如果構(gòu)建具有多個(gè)MVN單體的凝集素 寡聚復(fù)合體蛋白，將會(huì)使其分子具有更多的糖鏈結(jié)合位點(diǎn)，從而增強(qiáng)其結(jié)合病毒和阻抑病 毒侵染宿主細(xì)胞的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是應(yīng)用分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)，提供一種新的凝集素蛋白寡聚 復(fù)合體的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供上述方法構(gòu)建的凝集素蛋白寡聚復(fù)合體。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是利用上述凝集素蛋白寡聚復(fù)合體構(gòu)建方法構(gòu)建的凝集素蛋 白寡聚復(fù)合體在實(shí)際中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種凝集素蛋白寡聚復(fù)合體的構(gòu)建方法，將至少兩個(gè)凝集素蛋白單體的核酸序列 克隆并串聯(lián)連接至蛋白表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建凝集素蛋白寡聚復(fù)合體的重組表達(dá) 載體，由所述重組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)獲得凝集素蛋白寡聚復(fù)合體。上述的凝集素為包含MVN 在內(nèi)的所有類型的凝集素。本發(fā)明所述的構(gòu)建方法適用于所有凝集素的蛋白寡聚復(fù)合體的 構(gòu)建，并不僅限于MVN。
[0010]優(yōu)選的，所述的凝集素蛋白寡聚復(fù)合體為凝集素蛋白單體按串聯(lián)順序排列的凝集 素蛋白二聚體、凝集素蛋白三聚體、凝集素蛋白四聚體及四個(gè)以上凝集素蛋白單體組成的 復(fù)合體，且各凝集素蛋白單體之間具有間隔序列。
[0011] 所述凝集素蛋白二聚體的重組表達(dá)載體為將兩個(gè)凝集素蛋白單體的核酸序列插 入到蛋白表達(dá)載體的NdeI、BamHI和Xhol三個(gè)酶切位點(diǎn)之間，所述凝集素蛋白三聚體的重組 表達(dá)載體為將三個(gè)凝集素蛋白單體的核酸序列插入到蛋白表達(dá)載體的NdeI、BamHI、Ec 〇rI 和Xhol四個(gè)酶切位點(diǎn)之間，所述凝集素蛋白四聚體的重組表達(dá)載體為將四個(gè)凝集素蛋白單 體的核酸序列插入到蛋白表達(dá)載體的Ndel、BamHI、EcorI、SacI和Xhol五個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
[0012] 所述的凝集素蛋白二聚體為MVN-D i 2、MVN-D i 6和MVN-D i 10;所述的凝集素蛋白三 聚體為^1^2、]\^^1^6和醫(yī)11^10;所述的層~四聚體為層1^^杜32，]\^1^^杜&6和 MVN-TetralO；
[0013] 上述各凝集素蛋白寡聚復(fù)合體的重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程為：
[0014] 表達(dá)所述凝集素蛋白二聚體MVN-Di2的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示的MVN 基因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-Ndel For/MVN-BamHI2 Rev、MVN-BamHI2 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有Ndel和BamHI酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有BamHI和Xhol酶切 位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有Ndel和BamM酶切位點(diǎn)的目的基因片段雙酶切后連接至pET-30a載體，構(gòu)建MVN-Di2中間載體I;將帶有BamHI和Xho頂每切位點(diǎn)的目的基因片段雙酶切后 連接至MVN-Di 2中間載體I構(gòu)建成表達(dá)所述二聚體MVN-Di 2的重組表達(dá)載體；
[0015] 表達(dá)所述凝集素蛋白二聚體MVN-Di6的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-Ndel For/MVN-BamHI6 Rev、MVN-BamHI6 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有Ndel和BamHI酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有BamHI和Xhol酶切 位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有Ndel和BamM酶切位點(diǎn)的目的基因片段雙酶切后連接至pET-30a載體，構(gòu)建MVN-Di6中間載體I;將帶有BamHI和Xho頂每切位點(diǎn)的目的基因片段雙酶切后 連接至MVN-D i 6中間載體I構(gòu)建成表達(dá)所述二聚體MVN-D i 6的重組表達(dá)載體；
[0016] 表達(dá)所述凝集素蛋白二聚體MVN-Diio的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-Ndel For/MVN-BamHI 10 Rev、MVN-BamHI 10 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有Ndel和BamHI酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有BamHI和Xhol酶切 位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有Ndel和BamM酶切位點(diǎn)的目的基因片段雙酶切后連接至pET-30a載體，構(gòu)建MVN-DilO中間載體I;將帶有BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)的目的基因片段雙酶切后 連接至MVN-Di 10中間載體I構(gòu)建成表達(dá)所述二聚體MVN-Di 10的重組表達(dá)載體；
[0017] 表達(dá)所述凝集素蛋白三聚體MVN-Tri2的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-BamHI2 For/MVN-EcorI2 Rev、MVN-EcorI2 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有BamHI和EcoH酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有Ecorl和Xhol酶 切位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有BamHI和Ecorl酶切位點(diǎn)的目的基因片段酶切后連接至所述 的MVN-Di 2中間載體I，構(gòu)建MVN-Tr i 2中間載體Π ，將帶有Ecor I和Xho頂每切位點(diǎn)的目的基因 片段酶切后連接至MVN-Tri2中間載體Π ，構(gòu)建成表達(dá)所述三聚體MVN-Tri2的重組表達(dá)載 體；
[0018] 表達(dá)所述凝集素蛋白三聚體MVN-Tri6的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-BamHI6 For/MVN-EcorI6 Rev、MVN-EcorI6 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有BamHI和EcoH酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有Ecorl和Xhol酶 切位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有BamHI和Ecorl酶切位點(diǎn)的目的基因片段酶切后連接至所述 的MVN-Di 6中間載體I，構(gòu)建MVN-Tr i6中間載體Π ，將帶有Ecor I和Xho頂每切位點(diǎn)的目的基因 片段酶切后連接至MVN-Tri6中間載體Π ，構(gòu)建成表達(dá)所述三聚體MVN-Tri6的重組表達(dá)載 體；
[0019] 表達(dá)所述凝集素蛋白三聚體MVN-TrilO的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示MVN 基因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-BamHI 10 For/MVN-Ecorl 10 Rev、MVN-EcorI 10For/MVN-Xhol Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有BamHI和EcoH酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有Ecorl和 Xhol酶切位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有BamHI和Ecorl酶切位點(diǎn)的目的基因片段酶切后連接 至所述的MVN-Di 10中間載體I，構(gòu)建MVN-Tr i 10中間載體Π ，將帶有Ecor I和Xho頂每切位點(diǎn)的 目的基因片段酶切后連接至MVN-TrilO中間載體Π ，構(gòu)建成表達(dá)所述三聚體MVN-TrilO的重 組表達(dá)載體；
[0020] 表達(dá)所述凝集素蛋白四聚體MVN-Tetra2的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No. 1所示MVN 基因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-EcorI2 For/MVN-SacI2 Rev、MVN-SacI2 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有EcorI3和SacI酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有SacI和Xhol酶切 位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有EcorI3和SacI酶切位點(diǎn)的目的基因片段酶切后連接至所述的 MVN-Tri2中間載體Π ，構(gòu)建MVN-Tetra2中間載體ΙΠ ，將帶有SacI和Xhol酶切位點(diǎn)的目的基 因片段酶切后連接至MVN-Tetra2中間載體ΙΠ ，構(gòu)建成表達(dá)所述四聚體MVN-Tetra2的重組表 達(dá)載體；
[0021] 表達(dá)所述凝集素蛋白四聚體MVN-Tetra6的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示MVN 基因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-EcorI6 For/MVN-SacI6 Rev、MVN-SacI6 For/MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有EcorI3和SacI酶切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有SacI和Xhol酶切 位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有EcorI3和SacI酶切位點(diǎn)的目的基因片段酶切后連接至所述的 MVN-Tri6中間載體Π ，構(gòu)建MVN-Tetra6中間載體ΙΠ ，將帶有SacI和Xhol酶切位點(diǎn)的目的基 因片段酶切后連接至MVN-Tetra6中間載體ΙΠ ，構(gòu)建成表達(dá)所述四聚體MVN-Tetra6的重組表 達(dá)載體；
[0022] 表達(dá)所述凝集素蛋白四聚體MVN-TetralO的重組表達(dá)載體：以SEQ ID No.l所示 MVN基因序列為模板采用兩對(duì)引物MVN-EcorI10 For/MVN-SacI10 Rev、MVN-SacI10 For/ MVN-XhoI Rev進(jìn)行擴(kuò)增分別獲得帶有EcorI3和Sac頂每切位點(diǎn)的目的基因片段和帶有SacI 和Xhol酶切位點(diǎn)的目的基因片段，將帶有EcorI3和SacI酶切位點(diǎn)的目的基因片段酶切后連 接至所述的MVN-Tri 10中間載體Π ，構(gòu)建MVN-TetralO中間載體ΙΠ ，將帶有