一種牛趨化因子介導(dǎo)的o型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋白及疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于口蹄疫免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛趨化因子介導(dǎo)的0型口蹄疫靶 向性復(fù)合表位蛋白及疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。主要侵害對象為牛、羊和豬 等主要畜種及其它家養(yǎng)和野生偶蹄動物，易感者多達(dá)70余種。發(fā)病動物的特征癥狀是口、 鼻、蹄和母畜乳頭等部位發(fā)生水泡，或水泡破損后形成的潰瘍或斑痂，表現(xiàn)流涎、跛行和臥 地，由此導(dǎo)致生產(chǎn)力大幅下降?？谔阋邆魅拘詮?，發(fā)病率高達(dá)100%，可造成巨大的經(jīng)濟損失 和社會政治影響，素有"政治經(jīng)濟病"之稱，國際動物衛(wèi)生組織(0ΙΕ)將該病列為必需通報的 重大動物傳染病，我國也將該病列為一類重大動物傳染病之首。
[0003] FMDV不僅宿主范圍廣，傳播迅速，變異快，而且血清型眾多，共有A、0、C、Asia 1、 SAT1、SAT2和SAT3七個血清型，各血清型間缺乏交叉保護(hù)性，同一血清型的不同亞型或分 離株間的抗原變異很大。近年來，全球除C型口蹄疫未見流行外，其他6個血清型都在流 行。A型和0型流行面最廣，其次為Asial型和SAT2型。目前，對于口蹄疫的防治以免疫接 種滅活疫苗為主，該疫苗為FMD疫情防控做出了重大貢獻(xiàn)。歐洲經(jīng)歷了十多年的滅活疫苗接 種后，疫情得到了控制，多數(shù)國家達(dá)到了無疫標(biāo)準(zhǔn)。但滅活疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用存在諸多的缺 點。即生產(chǎn)該疫苗需要繁殖大量的活病毒，存在病毒逃逸的風(fēng)險;非純化的滅活疫苗免疫動 物(尤其是多次免疫)會產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，給以非結(jié)構(gòu)蛋白為基礎(chǔ)的感染動物與免疫動 物鑒別診斷帶來干擾;需要冷鏈運輸和低溫貯存以保證抗原穩(wěn)定性;疫苗免疫不能阻斷形 成病毒攜帶狀態(tài)，更為嚴(yán)重的是病毒滅活不完全有引發(fā)疫情的危險。為了克服這些缺點，研 究者一直在尋找一種更為安全有效的口蹄疫新型疫苗。隨著口蹄疫病毒抗原結(jié)構(gòu)日益明 朗，免疫學(xué)方面的新理論與新方法的不斷發(fā)展，在疫苗分子設(shè)計、復(fù)合表位疫苗與免疫佐劑 等方面都取得了明顯進(jìn)展。
[0004] 表位蛋白疫苗與滅活疫苗相比，具有以下優(yōu)點：生產(chǎn)過程不涉及活病毒，不存在散 毒的風(fēng)險;既可隨時根據(jù)流行毒株的變化調(diào)整表位序列，也可使用不同的抗原序列，增加抗 原的廣譜性;利用非疫苗用表位建立的診斷方法可對疫苗免疫和自然感染動物進(jìn)行有效區(qū) 分。近年來，表位疫苗逐漸成為研究的熱點。大量研究表明，表位蛋白疫苗在豬體試驗是成 功的（Cubillos et al, 2008;Shao et al, 2011;Cao et al, 2013,2014)。但是在牛上不 能獲得有效的保護(hù)（Taboga et al, 1997;Rodriguez et al, 2003)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有表位蛋白疫苗對牛體免疫效果差的缺陷，提供一種牛趨 化因子介導(dǎo)的〇型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋白及疫苗。利用本發(fā)明的XCL-0B7靶向性復(fù)合表 位蛋白疫苗免疫牛，能夠產(chǎn)生較高的抗體水平，以及較好的保護(hù)性免疫效果，是一種安全的 口蹄疫新型疫苗。
[0006] 為了提高表位蛋白疫苗對牛的免疫效果，將表位蛋白分子靶向于樹突狀細(xì)胞(DC) 表面受體，將有可能提尚表位蛋白的抗原遞呈效率，進(jìn)而提尚表位疫苗的免疫效果。DC是最 重要的抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)，通過其表面受體介導(dǎo)的胞吞、胞 飲與吞噬作用，對自身產(chǎn)生的病變細(xì)胞與入侵病原進(jìn)行監(jiān)視與清除，在啟動與控制獲得性 免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。通過DC表面受體將抗原靶向到DC，可以顯著提高抗原 遞呈效率，即使少量的抗原也能夠刺激產(chǎn)生較高的細(xì)胞免疫與體液免疫。近來發(fā)現(xiàn)趨化因 子受體XCR1僅表達(dá)于一群具有抗原交互遞呈功能的DC，是C型趨化因子XCL1唯一的受體。通 過XCL1將抗原靶向到這類DC，不但具有很高的特異性，而且靶向的抗原可以通過MHC-I與 MHC-II兩類分子交叉遞呈抗原給⑶8+T細(xì)胞(CTL)與⑶4+ T細(xì)胞，從而產(chǎn)生強而持久的細(xì)胞 免疫與體液免疫應(yīng)答。XCL1的氨基酸序列在不同種屬動物之間有差異，因而具有種屬特異 性。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種融合牛趨化因子XCL1的0型口蹄疫靶向性復(fù)合表 位蛋白，所述靶向性復(fù)合表位蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID No.2。
[0008] 本發(fā)明的牛0型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋白包含N端融合的牛趨化因子XCL1序列， 中國型（Cathay)、泛亞、緬甸98三個譜系0型FMDV主要中和性抗原表位區(qū)、通用T細(xì)胞表位、 FMDV特異性T細(xì)胞表位以及表位間的間隔序列，增加 FMDV特異性T細(xì)胞表位旨在提高對牛的 FMDV特異性細(xì)胞免疫效果。表位間的間隔序列有助于蛋白形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，提高蛋白 的免疫原性;在重組蛋白末端融合有6個組氨酸標(biāo)簽，以便于表位蛋白的分離純化。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供編碼權(quán)利要求1所述的牛趨化因子介導(dǎo)的0型口蹄疫 靶向性復(fù)合表位蛋白的核苷酸； 作為優(yōu)選，所述核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種牛趨化因子介導(dǎo)的0型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋 白疫苗，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制備而成;所述水相的溶質(zhì)為權(quán)利要求1所述 的牛趨化因子介導(dǎo)的〇型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋白。
[0011 ]作為優(yōu)選，所述油相為油佐劑。
[0012] 作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述油佐劑為Montanide ISA-201油佐劑。
[0013] 作為優(yōu)選，所述水相和油相的體積比為1: (0.95-1.05)。
[0014] 作為優(yōu)選，所述疫苗的主要組分含量為權(quán)利要求1所述的牛趨化因子介導(dǎo)的0型口 蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋白500yg/mL. 作為優(yōu)選，所述疫苗的免疫有效量為每頭份2ml。
[0015] 本發(fā)明的第四個目的是提供上述疫苗的制備方法，將權(quán)利要求1所述的牛趨化因 子介導(dǎo)的〇型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，得到水相;將水相與油相等 溫度充分混合，乳化，得疫苗。
[0016] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述牛趨化因子介導(dǎo)的0型口蹄疫靶向性復(fù)合表位蛋 白在制備牛0型口蹄疫疫苗中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的第六個目的是提供上述疫苗在制備預(yù)防和/或控制牛0型口蹄疫的藥物 中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的有益效果： 牛免疫試驗結(jié)果表明，免疫1 mg XCL-0B7后，7天就可檢測到FMDV特異性中和抗體，抗 體效價不斷升高，至21天抗體效價達(dá)最高，加強免疫后抗體效價迅速升高。非祀向性的0B7 抗原加入Toll樣受體激動劑P 〇ly(I:C)(pIC)后，也產(chǎn)生了高水平的抗體應(yīng)答，但早期抗體 應(yīng)答水平，明顯低于XCL-0B7靶向性抗原免疫牛。靶向性XCL-0B7抗原加入Tol 1樣受體激動 劑P〇ly(I:C)后，初免后的抗體應(yīng)答水平相比前兩組反而降低，二免后的抗體水平相比前兩 組不升反降，顯示出P〇ly(I:C)與XCL具有相反的作用，顯示出單獨的XCL靶向性抗原分子在 誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面具有明顯的優(yōu)勢。而PBS對照組動物始終沒有檢測到FMDV特異性抗 體。特異型抗體檢測結(jié)果顯示，首免與加強免疫后IgGl型抗體均高于IgG2型抗體，說明機體 通過Th2型細(xì)胞因子調(diào)控免疫應(yīng)答。加強免疫后第42天用200微升含10000個BID50的0/ Mya/98 口蹄疫病毒攻毒，X07免疫組牛只有1頭發(fā)病，其余4頭牛獲得完全保護(hù);而PBS免疫組 牛全部發(fā)病。說明重組X07抗原是一種很好的免疫原，免疫牛能夠產(chǎn)生較高的體液免疫，以 及較好的保護(hù)性免疫效果，是一種安全的口蹄疫新型疫苗。
【附圖說明】
[0019] 附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為XCL-0B7抗原表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖。1為蛋白分子量Marker; 2為重組菌pET28a-XCL-0B7誘導(dǎo)5h產(chǎn)物；3為未誘導(dǎo)的重組菌pET28a-XCL-0B7對照;4為空載體pET28a誘導(dǎo)對 昭