核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置和核酸擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置和核酸擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著基因利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫(yī)療受到矚 目，除此之外，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域也開發(fā)出多種將基因用于品種鑒別、品種改良的方法。作 為用于利用基因的技術(shù)，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction)法等核酸擴(kuò) 增技術(shù)正在廣泛普及。近年來，開發(fā)了能夠用更短的時(shí)間得到核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的PCR裝 置（例如，專利文獻(xiàn)1)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的制備中，重要的是氯化鎂濃度的設(shè)定，若低 濃度則收量減少，若高濃度則阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)或可能成為非特異性擴(kuò)增的原因。在眾多 的已知種類的市售品中，進(jìn)行核酸擴(kuò)增的反應(yīng)液中的氯化鎂的推薦濃度為1. 5mM(例如，參 照非專利文獻(xiàn)1、2)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0004] 專利文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2012-115208
[0006] 非專利文獻(xiàn)
[0007] 非專利文獻(xiàn)1 :東洋紡株式會(huì)社Lifescience事業(yè)部，PCR相關(guān)故障分析的網(wǎng) http://www. toyobo. co. jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/ archives/2008/04/post_21. html
[0008] 非專利文獻(xiàn)2 :Life technologies公司，TaqDNA聚合酶和PlatinumTaq抗體的說 明書，6 頁，http://tools. lifetechnologies. com/content/sfs/productnotes/f_050711_ taq-ts-tl-mkt-hl. pdf

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明人在使用了上述的PCR裝置的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)如果縮短反應(yīng)時(shí)間，特 別是縮短退火時(shí)間或退火和延伸時(shí)間，則與反應(yīng)時(shí)間長的情況相比得不到足夠量的核酸擴(kuò) 增反應(yīng)產(chǎn)物。因此本發(fā)明的課題在于提供一種即使反應(yīng)時(shí)間短也能夠得到足夠量的核酸擴(kuò) 增反應(yīng)產(chǎn)物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置和核酸擴(kuò)增方法。
[0010] 本發(fā)明是為了解決上述課題中的至少一部分而進(jìn)行的，能夠以以下方式實(shí)現(xiàn)。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，包含：安裝部，可安裝填充有核 酸擴(kuò)增反應(yīng)液和比重小于核酸擴(kuò)增反應(yīng)液且不與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混合的液體的核酸擴(kuò)增 反應(yīng)容器；第1加熱部，將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第1區(qū)域加熱到第1溫度；第2加熱部，將 核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第2區(qū)域加熱到第2溫度；驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，對(duì)第1配置和第2配置進(jìn)行切 換，其中，上述第1配置為第1區(qū)域在重力作用的方向位于第2區(qū)域的下方，上述第2配置 為第2區(qū)域在重力作用的方向位于第1區(qū)域的下方；并且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的鎂離子濃度為 1. 8mM~9. OmM。核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的鎂離子濃度可以為2. OmM~7. 5mM。核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置 進(jìn)一步具有控制驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的控制部，控制部保持上述第1配置的時(shí)間可以為4. 5秒以下，保 持上述第2配置的時(shí)間可以為18秒以下?？刂撇勘３稚鲜龅?配置的時(shí)間可以為4秒以 下?？刂撇勘３稚鲜龅?配置的時(shí)間可以為6秒以下。
[0012] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒具備： 管、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器和柱塞，其中，上述管在其內(nèi)部依次具備由第1油構(gòu)成的第1塞子、 由不與油混合的、對(duì)結(jié)合有核酸的核酸結(jié)合性固相載體進(jìn)行清洗的清洗液構(gòu)成的第2塞 子、由第2油構(gòu)成的第3塞子、由不與油混合的、從結(jié)合有核酸的核酸結(jié)合性固相載體溶出 上述核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子、由第3油構(gòu)成的第5塞子、由不與油混合的、進(jìn)行核酸 擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液構(gòu)成的第6塞子、由第4油構(gòu)成的第7塞子，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng) 用容器與管的第7塞子側(cè)連通，且包含油，上述柱塞安裝于管的第1塞子側(cè)的開口部，從管 的第7塞子側(cè)向核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器推出液體，并且，溶出液和核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的混合液 的鎂離子濃度為1. 8mM~9. OmM。
[0013] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒具備 管、核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器和柱塞，上述管在其內(nèi)部依次具備由第1油構(gòu)成的第1塞子；由不與 油混合的、對(duì)結(jié)合有核酸的核酸結(jié)合性固相載體進(jìn)行清洗的清洗液構(gòu)成的第2塞子；由第 2油構(gòu)成的第3塞子、由不與油混合的、從結(jié)合有核酸的核酸結(jié)合性固相載體溶出上述核酸 的溶出液構(gòu)成的第4塞子；由第3油構(gòu)成的第5塞子；上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器與管的第5 塞子側(cè)連通，且包含油，上述柱塞安裝于管的第1塞子側(cè)的開口部，從管的第5塞子側(cè)向核 酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器推出液體，核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器包含由不與油混合的、進(jìn)行核酸擴(kuò)增反 應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液形成的液滴，并且，溶出液和核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的混合液的鎂離子濃度 為 1. 8mM ~9. OmM。
[0014] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒，上述酸擴(kuò)增反應(yīng)用筒具備：管、核 酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器和柱塞，上述管在其內(nèi)部依次具備由第1油構(gòu)成的第1塞子；由不與油混 合的、對(duì)結(jié)合有核酸的核酸結(jié)合性固相載體進(jìn)行清洗的清洗液構(gòu)成的第2塞子；由第2油構(gòu) 成的第3塞子；由不與油混合的、從結(jié)合有核酸的核酸結(jié)合性固相載體溶出上述核酸的溶 出液構(gòu)成的第4塞子；由第3油構(gòu)成的第5塞子；上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器與管的第5塞子 側(cè)連通，且包含油，上述柱塞安裝于管的第1塞子側(cè)的開口部，從管的第5塞子側(cè)向上述核 酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器推出液體，并且，溶出液的鎂離子濃度為1. 8mM~9. OmM。
[0015] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增方法，上述核酸擴(kuò)增方法包含如下工序： 將核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的第1區(qū)域加熱到第1溫度的工序，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器填充有核 酸擴(kuò)增反應(yīng)液和比重小于核酸擴(kuò)增反應(yīng)液且不與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混合的液體；將核酸擴(kuò)增 反應(yīng)容器的第2區(qū)域加熱到比上述第1溫度低的第2溫度的工序；在第1配置保持第1時(shí) 間，使核酸擴(kuò)增反應(yīng)液在第1區(qū)域移動(dòng)的工序，上述第1配置為第1區(qū)域在重力作用的方向 位于第2區(qū)域的下向；在第2配置保持第2時(shí)間，使核酸擴(kuò)增反應(yīng)液在第2區(qū)域移動(dòng)的工 序，第2區(qū)域在重力作用的方向位于第1區(qū)域的下方；并且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的鎂離子濃度 為1. 8mM~9. OmM。第1時(shí)間可以為4. 5秒以下，第2時(shí)間可以為18秒以下。
[0016] 本發(fā)明的又一實(shí)施方式是一種核酸擴(kuò)增方法，該核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行規(guī)定次數(shù)的循 環(huán)，上述循環(huán)包括如下工序：將核酸擴(kuò)增反應(yīng)液在不與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液混合的液體的第1 溫度的第1區(qū)域中保持4. 5秒以下的時(shí)間的工序；在比第1溫度低的第2溫度的第2區(qū)域 中使核酸擴(kuò)增反應(yīng)液移動(dòng)的工序；將核酸擴(kuò)增反應(yīng)液在第2區(qū)域中保持18秒以下的時(shí)間的 工序；并且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的鎂離子濃度為1. 8mM~9. OmM。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種新的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置和核酸擴(kuò)增方法。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的截面圖。g表示重力的方 向。
[0019] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的升降式PCR裝置的立體圖。（A)表示關(guān)閉蓋 的狀態(tài)，（B)表示打開蓋的狀態(tài)。
[0020] 圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的升降式PCR裝置的主體的分解立體圖。
[0021] 圖4是示意地表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的升降式PCR裝置的主體的沿圖 2㈧的A-A線的截面的截面圖。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。
[0022] 圖5是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的筒的說明圖。
[0023] 圖6是表示鎂離子濃度與核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的關(guān)系的圖。
[0024] 圖7是表示鎂離子濃度與核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的關(guān)系的圖。
[0025] 圖8是表示鉀離子濃度與核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的關(guān)系的圖。
[0026] 圖9是表示鉀離子濃度與核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的關(guān)系的圖。
[0027] 圖10是表示鎂離子濃度與核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的關(guān)系的圖。
[0028] 圖11是表示鎂離子濃度與核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物量的關(guān)系的圖。
[0029] 圖12是表示核酸擴(kuò)增反應(yīng)液中的鎂離子濃度為5mM時(shí)的本發(fā)明的實(shí)施例和比較 例中的有無特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。
[0030] 圖13是表示核酸擴(kuò)增反應(yīng)液中的鎂離子濃度為5mM時(shí)的本發(fā)明的實(shí)施例和比較 例中的有無特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)及其構(gòu)思，通過本說明書的記載對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言 是明確的，根據(jù)本說明書的記載，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記 載的發(fā)明的實(shí)施方式和具體的實(shí)施例等表示本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，是用于例示或說明而 示出的，本發(fā)明不限于這些。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以確定在本說明書中公開的本發(fā)明 的意圖和范圍內(nèi)，基于本說明書的記載，可以進(jìn)行各種改變和修飾。
[0032] (1)核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器
[0033] 本發(fā)明的方法中使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器包含反應(yīng)液和與反應(yīng)液比重不同而發(fā) 生相分離的液體，且具有密閉了的容器，反應(yīng)液為液滴狀，液體包含油和添加劑。
[0034] 圖1是核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的截面圖。圖1表示在核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器裝入了反 應(yīng)液的狀態(tài)。
[0035] 本發(fā)明中使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100包括容器150和密封部120而構(gòu)成。核酸 擴(kuò)增反應(yīng)容器100的大小、形狀沒有特別限定，例如，可以考慮不與反應(yīng)液140混合的液體 130的量、導(dǎo)熱系數(shù)、容器150和密封部120的形狀或操作的容易度中的至少一個(gè)而進(jìn)行設(shè) 計(jì)。
[0036] 核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的容器150可以由透明的材質(zhì)形成。因此，可以從核酸擴(kuò) 增反應(yīng)容器100的外部對(duì)容器150內(nèi)的反應(yīng)液140的移動(dòng)進(jìn)行觀察，或者可以用于實(shí)時(shí)熒 光定量PCR等從容器150的外部進(jìn)行測(cè)定等的用途。應(yīng)予說明，本說明書中所說的"透明" 的情況是指能夠確保可從容器150的外部觀察容器150內(nèi)的反應(yīng)液140的程度的可視性， 只要滿足該條件，可以不必使核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的整體為透明。
[0037] 核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100的用途沒有特別限定，例如用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR這樣的 伴有熒光測(cè)定的用途時(shí)，容器150優(yōu)選由自發(fā)熒光小的材質(zhì)形成。容器150優(yōu)選為可耐受 PCR中的加熱的材質(zhì)。而且，容器150的材質(zhì)優(yōu)選為對(duì)核酸、蛋白質(zhì)的吸附少且不阻礙由聚 合酶等引起的酶反應(yīng)的材質(zhì)。作為滿足這些條件的材質(zhì)，沒有特別限定，例如，可以為聚丙 烯、聚乙烯、環(huán)烯烴聚合物（例如，ΖΕ0ΝΕΧ(注冊(cè)商標(biāo)）480R)、耐熱玻璃（例如PYREX(注冊(cè) 商標(biāo)）玻璃）等或它們的復(fù)合材料，優(yōu)選聚丙烯。
[0038] 在圖1所示的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100中，容器150形成為圓筒狀，中心軸方向（圖 1中的上下方向）為長邊方向。這里使用的容器150優(yōu)選為管，也可以為小型離心用管、設(shè) 計(jì)成PCR用的管，但通過具有長邊方向，即為細(xì)長的形狀，從而例如使用后述的升降型的熱 循環(huán)儀，以在容器150內(nèi)的液體130中形成溫度不同的區(qū)域的方式對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器100 進(jìn)行溫度控制時(shí)，易于增加不同的區(qū)域之間的距離。由此，易于對(duì)應(yīng)容器150內(nèi)的每個(gè)區(qū) 域，將液體130控制為不同的溫度，因此，能夠?qū)崿F(xiàn)適于PCR的熱循環(huán)。應(yīng)予說明，升降型的 熱循環(huán)儀是通過在充滿容器150的液體中形成至少2個(gè)溫度區(qū)域，使與液體發(fā)生相分離的 反應(yīng)液140在這些溫度區(qū)域間往返移動(dòng)而實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)的裝置。
[0039] 容器150的形狀只要具有長邊方向，就沒有特別限定，用于升降型PCR裝置時(shí)，在 大致圓筒形狀中內(nèi)徑D與長邊方向的長度L之比優(yōu)選為1:5~1. 5:20的范圍。而且，內(nèi)徑 D更優(yōu)選為1. 5~2mm，長度L更優(yōu)選為10~20mm〇
[0040] 容器150具有開口部和密封開口部的密封部120,容器150中含有反應(yīng)液140和與 反應(yīng)液140比重不同且發(fā)生相分離的液體130。通過密封部120密封