表達特定重組蛋白的功能化細菌磁顆粒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領域和納米磁珠材料領域，具體是涉及表達特定重組蛋白 的功能化細菌磁顆粒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 細菌磁顆粒是趨磁細菌生產的一種磁性納米顆粒，內核是Fe304晶體，外面有一層 磷脂生物膜包被，粒徑在30-120nm之間。同一種趨磁細菌生產的細菌磁顆粒粒徑大小和晶 體晶型基本一致，磁學性質均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性質和膠體性質。此 外，因為細菌磁顆粒是生物來源，因此具有較好的生物相容性。細菌磁顆粒膜上帶有大量的 氨基基團，可通過化學修飾和雙功能偶聯(lián)劑連接不同的功能大分子，如抗體，從而具有不同 的特殊功能。細菌磁顆粒最獨特的地方在于它可以通過基因工程的方法在細菌磁顆粒膜上 表達特殊的蛋白質，功能性的靶蛋白可以在細菌磁顆粒上展示出來。
[0003] 重組蛋白A(rProtein A)來源是金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus Protein A，SPA)，SpA是葡球菌胞璧蛋白，具有獨特的生物學活性，它能夠與哺乳動物免疫球蛋白IgG 的Fc段特異結合。天然的SPA具有5個同源結構域(A-E)能與IgG結合，但結合強度有差別，其 中的B結構域和I gG的結合力較好。重組蛋白G (rPr〇 t e in G )來源是鏈球菌蛋白G (Streptococcus Protein G，SPG)，SPG是A、C和G群鏈球菌的胞璧蛋白，能和人以及多種哺 乳動物的IgG以及人血清白蛋白（HSA)結合。SPG同IgG的親和力強，結合譜廣，SPG分子中的C 結構域負責同IgG的Fc段結合。
[0004] 現(xiàn)有技術公開了利用偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑分別將酶、抗體連接在細菌磁顆粒上，構建 磁性復合物，用于固定化酶或檢測病原菌等有害物質;這些方法的構建都是直接將細菌磁 顆粒與上述物質偶聯(lián)，而CN104278048公開了一種重組質粒，該質粒通過磁螺旋菌野生型菌 株MSR-1的基因組DNA為模板，通過帶有(GLy 4Ser)3Linker的引物擴增得到生物素羧基載體 蛋白基因?，F(xiàn)有技術公開的linker的氨基酸序列短，細菌磁顆粒膜蛋白與不同的抗體或蛋 白結合后，會產生兩者的空間結構相互影響的技術問題。
[0005] 并且重組蛋白A和重組蛋白G最普遍的應用是原核表達后偶聯(lián)到凝膠樹脂或者磁 珠上用作免疫分析及純化等用途。但現(xiàn)有技術中普遍存在著重組蛋白與磁珠或磁性顆粒結 合形成的顆粒與IgG的結合特異性差，負載IgG的載量低等技術問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種新的表達特定重組蛋白的功能化細菌磁 顆粒，該功能化細菌磁顆粒通過引入一個較長的多肽鏈，從而克服了兩種不同蛋白的空間 結構相互影響的技術問題，并且制備而成的功能化細菌磁顆粒與IgG的結合特異性強，負載 IgG的載量高。
[0007] 本發(fā)明具體技術方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供一種表達特定重組蛋白的功能化細菌磁顆粒，該功能化細菌磁顆粒的 結構物質由特定重組蛋白通過多肽鏈與細菌磁顆粒膜蛋白融合表達而成;所述多肽鏈的氨 基酸殘基為(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m = 2-5，n = 2-5，a = 2-5，b = 3-7〇
[0009] 進一步的改進，所述細菌磁顆粒膜蛋白基因為mamC或mamF。
[0010] 本發(fā)明提供的功能化細菌磁顆粒是由重組趨磁細菌合成，該重組趨磁細菌是通過 如下方法構建而成的：
[0011] a)構建細菌磁顆粒膜蛋白基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株；
[0012] b)構建功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒；
[0013] c)將功能化細菌磁顆粒融合表達質粒通過接合轉入至I」步驟&制得的趨磁細菌MSR-1突變株，構建重組趨磁細菌MSR-1。
[0014] 進一步的改進，述多肽鏈的氨基酸殘基為（AlamGlySer)n(GlyaSer)b (GlySerAlam)n，m=3，n = 3，a = 2_5，b = 3_7〇
[0015] 進一步的改進，a = 3，b = 5,多肽鏈的序列（如SEQ ID No.l所示）為5-GCAGCCGCTG GAAGCGCAGC CGCTGGAAGC GCAGCCGCTG GAAGCGGAGG TGGAAGCGGA GGTGGAAGCG GAGGTGGAAG CGGAGGTGGA AGCGGAGGTGGAAGCGGAAG CGCAGCCGCT GGAAGCGCAG CCGCTGGAAG CGCAGCCGCT- 3〇
[0016] 本發(fā)明通過提供的多肽鏈是一般柔性linker多肽長度的3倍;并且其兩端增加了 剛性的Ala殘基，以此用于穩(wěn)定兩個不同蛋白的空間結構，并且克服了兩個蛋白之間存在著 相互影響的技術問題。
[0017] 進一步的改進，特定重組蛋白為特定重組蛋白A，該特定重組蛋白A為在重組蛋白A 的B結構域的氨基酸的基礎上，將第29位Gly突變成Ala。
[0018] 優(yōu)選地，特定重組蛋白A的序列（如SEQIDNo.2所示)是：5-GCCGACAATAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCGT TCTATGAAAT TTTACATTTA CCTAATTTAA CTGAAGAACA ACGTAATGGC TTCATCCAAA GCCTTAAAGA CGATCCTTCA GTGAGCAAAG AAATTTTAGC CGAAGCGAAA AAGCTAAACG ATGCCCAAGC ACCAAAA GGTTCA GGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGC GCCGACA ATAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCTT TCTATGAAAT TTTACATTTA CCTAATTTAA CTGAAGAACA ACGTAATGGC TTCATCCAAA GCCTTAAAGA CGATCCTTCA GTGAGCAAAG AAATTTTAGC CGAAGCCAAA AAGCTAAATG ATGCGCAAGC GCCAAAA-3。
[0019] 將重組蛋白A的B結構域中第29位Gly突變成Ala可改良成Z結構域，可提高B結構域 的耐受性，具有結合IgG恒定區(qū)Fc段的高特異性。并且改良的Z結構域的寡聚體與IgG的結合 能力比重組蛋白A的B結構域或重組蛋白A要好。
[0020] 進一步的改進，所述特定重組蛋白為特定重組蛋白G，所述特定重組蛋白G為重組 蛋白G的C結構域二聚體。
[0021] 優(yōu)選地，特定重組蛋白G的序列（如SEQIDNo.3所示）是：5-ACTTACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAA GCAGTCGACG CAGAAACTGC AGAAAAAGCC TTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGA TGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A GGTTCA GGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGCGGC ACTT ACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAA GCAGTCGACG CAGAAACTGC AGAAAAAGCC TTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGA TGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A-3〇
[0022]本發(fā)明另一方面提供一種表達特定重組蛋白的功能化細菌磁顆粒的制備方法，該 方法包括如下步驟：
[0023] a.構建細菌磁顆粒膜蛋白基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株；
[0024] b.構建功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒；
[0025] c.將功能化細菌磁顆粒融合表達質粒通過接合轉入到步驟a制得的趨磁細菌MSR- 1突變株中，構建趨磁細菌MSR-1重組株，培養(yǎng)，制備功能化細菌磁顆粒；
[0026]優(yōu)選地，所述細菌磁顆粒膜蛋白基因為mamC或mamF。
[0027]進一步的改進，本發(fā)明還提供了細菌磁顆粒膜蛋白基因缺失的趨磁細菌MSR-1突 變株的構建方法，具體步驟如下：
[0028] (a)擴增細菌磁顆粒膜蛋白基因左右兩側共兩個長均為700_1000bp的同源片段； 左右兩同源片段均帶有兩個酶切位點；
[0029] (b)左右同源片段分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切；同時對自殺質粒 pK18mobsacB進行雙酶切；
[0030] (c)將經過雙酶切后的左右同源片段和經過雙酶切后的自殺質粒進行連接，連接 產物轉到E.coli感受態(tài)細胞中，挑選連接正確的陽性克隆菌；
[0031] (d)將陽性克隆菌作為供體與趨磁細菌MSR-1受體菌進行親本接合，并導入 pK18m〇bsaCB重組質粒，通過卡那抗性篩選趨磁細菌MSR-1同源整合突變株，突變株再通過 蔗糖梯度篩選趨磁細菌MSR-1雙交換突變株，最后選擇卡那抗性敏感的雙交換菌株進行驗 證，構建成細菌磁顆粒膜蛋白基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株。
[0032] 進一步的改進，本發(fā)明還提供了功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒的構建方 法，具體步驟如下：
[0033] (1)擴增細菌磁顆粒膜蛋白基因跨膜結構域的DNA片段，所述DNA片段兩端分別帶 有雙酶切位點；對擴增產物DNA片段及pBBR質粒進行雙酶