一種spl18基因在提高植物產(chǎn)量中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種SPL18基因的應(yīng)用，特別是在水稻、玉米和小麥等作物上用來調(diào)控 農(nóng)作物單穗粒數(shù)和粒重以及提高產(chǎn)量的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 人口的不斷增加和可耕種面積的減少，必須依靠提高農(nóng)作物單位面積產(chǎn)量才能滿 足人類的需求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來改良農(nóng)作物的性狀，如獲得抗蟲能力、抗除草劑 能力、增強(qiáng)抗干旱、抗病能力等。高產(chǎn)也是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物改良的重要內(nèi)容。例如，利用轉(zhuǎn)基因 表達(dá)一種植物的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量 (U. S. Pat. No. 7，598，529，4)。但是，農(nóng)作物產(chǎn)量是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，受到很多基因的調(diào) 控（Xing and Zhang, (2010)Annual Review of Plant Biology ,61:421-442)。研究和發(fā)掘 更多有重大應(yīng)用價值的新基因，并利用這些基因提高農(nóng)作物產(chǎn)量是目前農(nóng)作物研究的重中 之重。
[0003] "綠色革命"中，矮桿化提高了作物的抗倒伏性和收獲指數(shù)，通過合理密植和肥料 的大量使用，使得農(nóng)作物，特別是水稻和小麥的產(chǎn)量大幅提高(Monna et al.，（2002)DNA Research,9(1):11-17；Sasaki et al.,(2002)Nature,416(6882):701-702；Spielmeyer, (2002) Sci ences，99 (13): 9043-9048)。近年來，隨著收獲指數(shù)逐漸接近瓶頸值，育種家在水 稻上提出了理想株型（Ideal Plant Architecture)的概念。理想株型的主要性質(zhì)包括分蘗 數(shù)適中且無效分蘗少，單穗粒數(shù)增加，莖干更厚更結(jié)實(shí)(Khush，G. S.，（1995)Geo journal， 35:329-332)。因此，研究作物的穗粒數(shù)的調(diào)控機(jī)制，分離出關(guān)鍵基因并應(yīng)用到作物培育中， 是獲得高產(chǎn)作物的重要途徑。
[0004] SQUAMOSA(SQUA)promoter-binding-like(SPL)基因是在植株生長發(fā)育過程中起 關(guān)鍵作用的一類轉(zhuǎn)錄因子。SPLs是植物特有，具有一個保屬的大小約為78個氨基酸的SBP (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN)結(jié)構(gòu)域。這個結(jié)構(gòu)域包含3個重要的功能基序，即 鋅指l(Znl)、鋅指2(Zn2)和核定位信號（NLS)(Yamasaki et al.，（2004)Journal of Molecular Biology,337(1):49-63；Birkenbihl et al.,(2005)Journal of Molecular Biology,352(3):585-596；Preston and Hileman,(2013)Frontiers in Plant Science 4)。目前，在大多數(shù)植物中都發(fā)現(xiàn)了多個SPL基因，其中擬南芥、水稻、小立碗蘚、玉米、番茄 和楊樹中分別含有 16，19，13,31，15和28個(1^&11(11^，（2014)81?：?1&1^81〇1(^7 14)·。
[0005] 目前，對AtSPL基因已經(jīng)展開了很多研究，很多基因的功能及其調(diào)控機(jī)理也已經(jīng)清 楚。擬南芥中的16個SPL基因分別被命名為A t SPL 1 -A t SPL 16。其中A t SPL 1，A t SPL7，A t SPL 12， AtSPL14和AtSPL16編碼的蛋白的分子量相對較大，且為組成型表達(dá)；另外的編碼的蛋白分 子量相對較小，且主要在花器官中表達(dá)（Cardon et al.，（1999)Gene，237(l):91-104)。 AtSPL基因中大多數(shù)基因的表達(dá)都受MIR156家族的miRNAs調(diào)控。在這些基因中，AtSPL3， AtSPL4和AtSPL5,能促進(jìn)營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)換和開花（Cardon et al.，（1997)Plant Journal, 12(2):367-377；Gandikota et al.,(2007)Plant Journa,! 49(4):683-693)〇AtSPL2, AtSPL 和 AtSPLll 調(diào)控莖生葉和花的表型（Shikata et al.，（2009)Plant and Cell Physiology ,50(12) :2133-2145) jtSPLg和AtSPL15類似，都具有調(diào)控植株從幼苗生長期到 成熟生長期轉(zhuǎn)換和葉片生長速率的功能（Schwarz et al.，（2008)Plant Molecular Biology ,67(卜2) : 183-195.)。另外，六個AtSPL基因，包括AtSPLl，AtSPL7，AtSPL8， AtSPL12，AtSPL14和AtSPL16,不是miR156的靶標(biāo)基因。其中，AtSPL7能直接和銅反應(yīng)元件 (CuRE)結(jié)合，調(diào)控?cái)M南芥中銅離子的動態(tài)平衡（Yamasaki et al.，（2009)Plant Cell ,21 (1) :347-361) jtSPLS參與調(diào)控花粉囊的發(fā)育、雄性育性和GA的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo) (Zhang et al.，（2〇〇7)Plant Molecular Biology，63(3):429-439)<^七5卩1^ 4在植物發(fā)育 和對伏馬菌素 B1的敏感度中起到關(guān)鍵作用（Stone et al.，（2005)Plant Journal ,41(5): 744-754)〇
[0006] 近年來，水稻中的OsSPL基因的功能研究也取得了很多重要進(jìn)展。0sSPL14調(diào)控水 稻分蘗和單穗粒數(shù)，0sSPL14高表達(dá)能減少無效分蘗，促進(jìn)穗分支，增加單穗粒數(shù)，提高谷粒 產(chǎn)量（Jiao et al.，（2010)Nature Genetics，42(6):541_544;Miura et al. ,(2010) Nature Genetics ,42(6): 545-549)。進(jìn)一步研究表明，0sSPL14可能是通過和反向調(diào)控分蘗 芽生長的TE0SINTE BRANCHED1基因的啟動子直接結(jié)合，來抑制分蘗;通過直接和正向調(diào)控 一個穗形態(tài)的重要調(diào)控基因 DENSE AND ERECT PANICLE1，來影響株高和穗長(Lu et al.， (2013)Plant Cell ,25( 10) :3743-3759)。〇85?1^16(即GW8)蛋白正向調(diào)控細(xì)胞分裂，在水稻 中過表達(dá)該基因促進(jìn)細(xì)胞分裂和灌漿，使得種子變寬切谷物產(chǎn)量增加 （Wang et al.， (2012)Nature Genetics 44(8) :950-954) AW7是另外一個促進(jìn)谷粒變得細(xì)長的基因， 0sSPL16通過和GW7的啟動子結(jié)合抑制其表達(dá)來調(diào)控谷粒寬度(Wang et al.，（2015)Nature Genetics 47(8) :949-954)。但是，水稻中還有很多OsSPL基因的功能未知，更為深入和全面 的研究這些SPL基因?qū)Πl(fā)掘更多產(chǎn)量性狀調(diào)控基因和培育高產(chǎn)作物都非常重要。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是通過調(diào)控一種SPL18基因的表達(dá)，減少水稻無效分蘗，促進(jìn)穗分支， 單穗谷粒數(shù)增加且產(chǎn)量增加。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種SPL18基因在提高植物產(chǎn)量中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是將SPL18基因 與表達(dá)元件連接構(gòu)建表達(dá)框，然后將表達(dá)框?qū)胫参镏?，減少無效分蘗，促進(jìn)穗分支，增加 單穗粒數(shù)，實(shí)現(xiàn)植物增產(chǎn);所述表達(dá)元件包括啟動子、增強(qiáng)子和終止子;具體優(yōu)選方法為:將 SPL18基因、啟動子和終止子進(jìn)行功能性連接，獲得一個能夠在植物中表達(dá)的SPL18基因表 達(dá)框，然后通過植物轉(zhuǎn)化的方法將SPL18基因表達(dá)框?qū)胫参锏幕蚪M中使之表達(dá)，從而實(shí) 現(xiàn)植物高產(chǎn)，獲得谷物產(chǎn)量提高的改良轉(zhuǎn)基因植物。改良的轉(zhuǎn)基因植物是指與非轉(zhuǎn)基因的 親本植物相比，單穗粒數(shù)、產(chǎn)量至少增加3%。
[0010] 本發(fā)明提供的SPL18基因可以是來自任何植物，優(yōu)選自禾本科植物(單子葉植物或 雙子葉植物），比如來自玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、黑麥、小米、大豆、油菜或向日葵，特別 優(yōu)選來自水稻、玉米或大豆。一般可以預(yù)見這些來自不同植物的同源蛋白具有相同或者相 似的功能，因此同樣可以利用這些基因改良植物的農(nóng)藝性狀。進(jìn)一步，即使不能預(yù)見這些蛋 白的功能，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的方法和現(xiàn)有技術(shù)測定它們是否具 有促進(jìn)植物提早成熟的功能。
[0011]本發(fā)明所述的SPL18為具有一個保屬的大小約為78個氨基酸的SBP(SQUAM0SA PROMOTER BINDING PROTEIN)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明所述的SPL18基因包含的SBP結(jié)構(gòu) 域的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或者具有與其至少92.5%的序列一致性氨基酸序列。本發(fā) 明最優(yōu)選SPL基因?yàn)橄铝衼碓粗坏幕蚧蛳铝腥我恍蛄械耐葱蛄?，其編碼的SPL為下列 氨基酸序列之一或具有下列任一序列58%或70%或80%或90%以上同源性的序列：水稻 (Oryza sativa)中秈稻的0sSPL18基因（氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示，核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示）；粳稻的0sSPL18基因（氨基酸序列為SEQ ID N0:3所示，核苷酸序列為SEQ ID N0:7所示）；玉米(ZeamaiZe)的ZmSPL18基因（氨基酸序列為SEQIDN0 :4所示，核苷酸序列 為SEQ ID NO:8所示）。
[0012]編碼本發(fā)明SPL18基因的多核苷酸序列可以有多種不同的變異，多核苷酸序列的 變異包括但不限于：1)由于編碼同一個氨基酸的密碼子不同而獲得不同的多核苷酸序列， 這些序列編碼具有相同活性的蛋白質(zhì)多肽；2)來源于生物的遺傳多態(tài)性（Genetic Polymorphism)，即同一種植物的不同個體或者群體之間的多樣性;3)通過人工操作導(dǎo)入多 核苷酸序列的變異。人工導(dǎo)入的這種變異可以是隨機(jī)的變異，也可以是針對性的定向變異。 本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員就能通過分子生物學(xué)的方法產(chǎn)生點(diǎn)突變，插入或者缺失變異等。通 過人工操作導(dǎo)入多核苷酸序列的變異也包括通過Gene Shuffling等方法獲得仍然具有正 常功能的雜合基因。例如 U.S.Pat.No.2002/0058249;Stemmer(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature，370:389-391;Crameri et al.(1997)Nature Biotech.,15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.,272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc. Natl. Acad.Sci. USA,94:4504-4509