一種根霉菌胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)的萃取方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是于一種根霉菌（Rhizopus SPP)胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（Bio-act ive Induce matter :BA頂）的萃取方法及應(yīng)用，其是將根霉菌（Rhizopus SPP)培養(yǎng)于改良式 液體（Sabouraud Dextrose Agar)的培養(yǎng)基中，置放于30°C恒溫箱內(nèi)回轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)5日 后，取0. 2ml菌液涂抹在一改良式固體（Sabouraud Dextrose Agar)培養(yǎng)基中，靜置于 30°C恒溫箱中培養(yǎng)5日，在未出現(xiàn)黑色菌落前刮取白色菌落，并置放于無(wú)菌磷酸緩沖溶液 (Phosphate Buffer Solution :PBS) 10ml中，即成懸浮液后再進(jìn)行根霉菌胞內(nèi)萃取。其萃 取是以根霉菌懸浮液lOOOOxg轉(zhuǎn)數(shù)進(jìn)行離心分離10分鐘（4°C )后再取其菌體沉淀物，再 加入無(wú)菌磷酸緩沖溶液l〇ml再成懸浮液，再進(jìn)行離心分離連續(xù)重復(fù)三次后，再將完成沖洗 的菌體沉淀物以重量1 : 9(菌體沉淀物：PBS緩沖溶液）比例再成懸浮，連續(xù)進(jìn)行三次冷 凍（-80°C )及解凍（37°C水?。┑奶幚沓绦?，再以超音波細(xì)胞擊碎器進(jìn)行破壁（在水浴下 每間隔5分鐘破壁一次，連續(xù)進(jìn)行五次）。后再將破壁完成的懸浮菌液再以lOOOOxg轉(zhuǎn)數(shù)的 離心分離10分鐘（4°C以下）后，取其上清液以0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，其最后濾液即含有根霉 菌體胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（BA頂)，經(jīng)噴霧干燥即得本發(fā)明產(chǎn)品：BA頂（生理活性誘導(dǎo)分 泌物質(zhì)）。
【背景技術(shù)】
[0002] 孩童的成長(zhǎng)、發(fā)育及女性的不育、月事的不調(diào)、男性的禿發(fā)、不舉等異常現(xiàn)象 及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的產(chǎn)肉、產(chǎn)蛋、產(chǎn)乳及繁殖效率的良否等均受制于腦下垂體前葉（Anterior pituitary pars distalis)所支配于周邊腺體分泌特定激素（Hormones)的功能所致。而 此特定的激素包括：生長(zhǎng)激素 （FS H)、黃體生成素（LH)及泌乳素 （Lactation H)三者，而 腦下垂體控制周邊腺體分泌特定激素的功用，則受制于下視丘（Hypothalamus)分泌特定 激素所致。而下視丘分泌特定激素，可藉由生理活性物質(zhì)（Bio-avtive Induce matter)來(lái) 誘導(dǎo)刺激而得。
[0003] 1970年（44年前）日本牛越郁夫取得「應(yīng)用于動(dòng)物的生理活性物質(zhì)」發(fā)明專利 (昭45-12754號(hào)：間腦是爸經(jīng)由U τ下垂體爸刺激t §物質(zhì)多量含有t §物質(zhì)①制造法）， 其生理活性物質(zhì)取得制程是以Rhi zopus屬（Rhizopus SPP.)菌體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的取得 是采液態(tài)發(fā)酵低溫干燥的制程，其培養(yǎng)過(guò)程繁雜，含不純物高達(dá)8%，且濃縮干燥產(chǎn)品吸濕 性強(qiáng)，保存不易，致效果不穩(wěn)定。
[0004] 2014年中國(guó)臺(tái)灣發(fā)明證號(hào)：1434932號(hào)（根霉菌Rhizopus SPP及其培養(yǎng)方法與應(yīng) 用），其制程中培養(yǎng)菌體流程雖已簡(jiǎn)化且僅簡(jiǎn)易加工后，用于生醫(yī)資材，因成本昂貴效果不 彰未見(jiàn)推廣，顯見(jiàn)其制程技術(shù)猶有瑕疵、未臻完善。
[0005] 中國(guó)臺(tái)灣發(fā)明專利公開(kāi)號(hào)TW201343172A :是應(yīng)用少孢根霉菌 (RhizopusOligosporus)的發(fā)酵產(chǎn)物，以作為生產(chǎn)降血壓活性成分的用途醫(yī)藥組合物及其 食品添加物，其是以牛乳的培養(yǎng)基得到一發(fā)酵產(chǎn)物，其含有血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（抑 制ACE活性功能），作為降血壓劑，以牛乳作為培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)源，其發(fā)酵產(chǎn)物的成分目前被 公認(rèn)其成分最為不穩(wěn)定，雖有小白鼠動(dòng)物試驗(yàn)，但其臨床試驗(yàn)未經(jīng)確定。且目前治療高血壓 的化學(xué)合成藥劑因?qū)＠谝堰^(guò)，致成本非常便宜，且經(jīng)無(wú)數(shù)臨床試驗(yàn)效果確定。
[0006] 今地球人口已逾七十億，且日益嚴(yán)重地球的暖化現(xiàn)象，氣候激變，不是大澇即 大旱，導(dǎo)致人類的糧食日漸匱乏，尤其是對(duì)健康關(guān)系頗大的動(dòng)物性蛋白質(zhì)（乳、肉及蛋） 的需求更為迫切，經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的生產(chǎn)因飼養(yǎng)方式、營(yíng)養(yǎng)及飼養(yǎng)的氣候影響導(dǎo)致內(nèi)分泌激素 (Hormones)的分泌異常，而造成產(chǎn)肉、產(chǎn)蛋、產(chǎn)乳等產(chǎn)量的低下及繁殖上的障礙，致如何解 決孩童的成長(zhǎng)及成人賀爾蒙的失調(diào)及提升乳、肉及蛋的生產(chǎn)為目前重要研究探討課題。
[0007] 今發(fā)明人經(jīng)多年來(lái)的深入探討及研究，終于研發(fā)一種制程嚴(yán)謹(jǐn)、質(zhì)量穩(wěn)定及效果 佳，可誘導(dǎo)促進(jìn)人及動(dòng)物內(nèi)分泌腺分泌多量?jī)?nèi)分泌素（如生長(zhǎng)激素（GH)及激性腺素如： FSH、LH&Lactation Η 等）的生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（Bio-active Induce matter)簡(jiǎn)稱 BAIM， 以促使人類的健康幸福及取代目前使用添加瘦肉精或合成賀爾蒙來(lái)增加乳、肉、蛋產(chǎn)量危 害人類健康的替代方案以造福人類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問(wèn)題在于，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，而提供一 種根霉菌胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)的萃取方法及應(yīng)用，供誘導(dǎo)促進(jìn)人及動(dòng)物體內(nèi)分泌腺分泌 多量?jī)?nèi)分泌素，如生長(zhǎng)激素（GH)及激性腺素（FSH，LH&Lactation Η等）的生理活性誘導(dǎo)物 質(zhì)（ΒΑΙΜ)以促進(jìn)人類的健康及取代目前使用添加瘦肉精或合成荷爾蒙來(lái)增加乳、肉、蛋產(chǎn) 量危害人類健康的替代方案，并造福人群。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種根霉菌胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)的萃取方法及應(yīng)用，包括：
[0011] 根霉菌的培養(yǎng)。
[0012] 馬鈴薯萃取液及培養(yǎng)基制備。
[0013] 馬鈴薯萃取液制備。
[0014] 將馬鈴薯以自來(lái)水洗凈及削皮后，將每粒馬鈴薯粗切成8塊，再以蒸餾水與馬鈴 薯重量混合（2 : 1)。放入蒸煮鍋中100°C加熱60分鐘，使其總重量剩為2公斤。
[0015] 經(jīng)不銹鋼細(xì)網(wǎng)目過(guò)濾及取濾液，將濾液經(jīng)6, OOOxg離心分離15分鐘，取其上清液。
[0016] 前述步驟上清液經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜過(guò)濾，其濾液分裝置放于-20°c冰柜保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 改良式固體Sabouraud Dextrose Agar培養(yǎng)基配制：
[0018] 50g/L Dextrose、15g/L Peptone、15g/L Bacto agar、10%馬鈴墓萃取液、10g/L yeast extract power及2%脫脂奶粉等充份攪拌混合。
[0019] 經(jīng)高壓蒸汽滅菌釜滅菌121°C、15鎊壓力、15分鐘。
[0020] 液化培養(yǎng)基在50°C水浴后分裝于90X15mm培養(yǎng)皿中使其固化。
[0021] 改良式液體Sabouraud Dextrose Agar培養(yǎng)基配制：
[0022] 5〇g/L Dextrose、If5g/L Peptone、10 % 馬鈴薯萃取液、10g/L yeast extract power及2%脫脂奶粉等充份攪拌混合。
[0023] 經(jīng)高壓蒸汽滅菌釜滅菌121°C、15鎊壓力、15分鐘。
[0024] 液化培養(yǎng)基滅菌完成后放置于4°C冷藏保存。
[0025] 培養(yǎng)技術(shù)。
[0026] 將根霉菌培養(yǎng)于改良式液體Sabouraud Dextrose Agar培養(yǎng)基中，放置在恒溫箱 30 °C回轉(zhuǎn)式振蕩培養(yǎng)5日。
[0027] 取0. 2mL菌液涂抹在一改良式固體Sabouraud Dextrose Agar培養(yǎng)基中，靜置在 30旦溫箱培養(yǎng)5日。
[0028] 未出現(xiàn)黑色菌落前，刮取白色菌落并放置于無(wú)菌磷酸緩沖溶液中（phosphate buffer solution，PBS)，每5個(gè)培養(yǎng)皿刮下菌落于50mL PBS緩沖溶液中再懸浮。
[0029] 根霉菌菌體胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)萃取技術(shù)。
[0030] 將根霉菌懸浮液以10, 000xg轉(zhuǎn)數(shù)離心機(jī)離心10分鐘（4°C下），取其菌體沉淀物， 再取懸浮菌體沉淀物進(jìn)行離心，連續(xù)進(jìn)行重復(fù)三次。
[0031] 將完成沖洗的菌體沉淀物以重量1 : 9 (菌體沉淀物：PBS緩沖溶液）比例再懸浮， 連續(xù)進(jìn)行三次冷凍（_80°C )及解凍（37°C水?。┑奶幚沓绦?。
[0032] 以超音波細(xì)胞擊碎器進(jìn)行破壁，在冰浴下每5分鐘間隔一次，連續(xù)破壁五次（肉眼 上觀察不到菌體顆粒團(tuán)塊的均勻懸浮液）。
[0033] 將破壁完成的懸浮菌液再以10,000xg轉(zhuǎn)數(shù)的離心機(jī)進(jìn)行離心10分鐘（4°C下）， 取其上清液。
[0034] 將上清液經(jīng)0. 45 μπι過(guò)濾膜過(guò)濾，取其濾液即為根霉菌菌體胞內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物 質(zhì)萃取物。
[0035] 濃縮噴霧干燥。
[0036] 上述萃取液經(jīng)噴霧干燥，即得本發(fā)明產(chǎn)品（ΒΑ頂）粉末體。
[0037] 本發(fā)明的有益效果是，供誘導(dǎo)促進(jìn)人及動(dòng)物體內(nèi)分泌腺分泌多量?jī)?nèi)分泌素，如生 長(zhǎng)激素（GH)及激性腺素（FSH，LH&Lactation Η等）的生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（ΒΑ頂）以促進(jìn)人 類的健康及取代目前使用添加瘦肉精或合成荷爾蒙來(lái)增加乳、肉、蛋產(chǎn)量危害人類健康的 替代方案，并造福人群。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0039] 圖1為本發(fā)明的根霉菌萃取生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（ΒΑ頂）的制造流程圖。
[0040] 圖2為本發(fā)明的較佳實(shí)施生產(chǎn)及應(yīng)用示意圖。
[0041] 圖3為生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（ΒΑ頂）的作用機(jī)轉(zhuǎn)。
[0042] 圖中標(biāo)號(hào)說(shuō)明：
[0043] 1培養(yǎng)基制備
[0044] 2接種根霉菌（Rhizopus SPP)于培養(yǎng)基中培養(yǎng)
[0045] 3取出白色菌落，置入PBS緩沖液中而呈懸浮液
[0046] 4萃取菌體進(jìn)行破壁將胞內(nèi)多醣體的酵素及BA頂?shù)柔尦?br>[0047] 5純化生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（BA頂）
[0048] 6萃取物經(jīng)噴霧干燥而得BA頂粉末體
[0049] 7應(yīng)用于人體或動(dòng)物促進(jìn)內(nèi)分泌腺分泌
【具體實(shí)施方式】
[0050] 請(qǐng)參閱圖1、圖2所示，為本發(fā)明的根霉菌萃取生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（BAM)的制造 流程圖及較佳實(shí)施生產(chǎn)及應(yīng)用示意圖，本發(fā)明的一種根霉菌（Rhizopus SPP)培養(yǎng)及萃取胞 內(nèi)生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（Bio-active Induce matter :BAIM)的制程改良制作流程，如圖1所 示，其依序?yàn)榕囵B(yǎng)基制備1、接種根霉菌（Rhizopus SPP)于培養(yǎng)基中培養(yǎng)2、取出白色菌落， 置入PBS緩沖液中而呈懸浮液3、萃取菌體進(jìn)行破壁將胞內(nèi)多醣體的酵素及BA頂?shù)柔尦?、 純化生理活性誘導(dǎo)物質(zhì)（BA頂)5、萃取物經(jīng)噴霧干燥而得BA頂粉末體6、應(yīng)用于人體或動(dòng)物 促進(jìn)內(nèi)分泌腺分泌7,其主要是以：
[0051] 根霉菌的培養(yǎng)。
[0052] 馬鈴薯萃取液及培養(yǎng)基制備。
[0053] 馬鈴薯萃取液制備。
[0054] 將馬鈴薯以自來(lái)水洗凈及削皮后，將每粒馬鈴薯粗切成8塊，再以蒸餾水與馬鈴 薯重量混合（2 : 1)。放入蒸煮鍋中100°C加熱60分鐘，使其總