一種高抗氧化性刺參腸寡肽衍生物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種刺參腸寡肽衍生物的制備方法，更具體地說，涉及一種具有高抗 氧化活性的刺參腸寡肽衍生物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 刺參腸是刺參加工過程中的副產(chǎn)物，作為廢棄物丟棄后造成了資源浪費與環(huán)境污 染。而刺參腸本身蛋白質(zhì)含量豐富，可達61.13±0.89%左右（以干重計），但高值化利用度 卻很低。通過酶解反應(yīng)制備刺參腸肽，再經(jīng)過美拉德(Maillard)反應(yīng)進行糖基化，使其具備 較高的抗氧化能力，從而提高刺參腸的利用率，所獲得的高抗氧化活性的刺參腸寡肽衍生 物在食品領(lǐng)域?qū)⒕哂辛己玫膽?yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種副產(chǎn)物刺參腸的再加工工藝，提高刺參加工過程中副 產(chǎn)物的利用率，避免資源浪費與環(huán)境污染；另外，根據(jù)刺參腸本身蛋白質(zhì)含量豐富的特點， 開發(fā)一種利用刺參腸制備具有高抗氧化活性產(chǎn)品的方法，同時，保證該方法具有條件溫和、 工藝簡單、生產(chǎn)效率高等特點。
[0004] 為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種高抗氧化性刺參腸寡肽衍生物的制備方法， 包括如下步驟：
[0005] S1、刺參腸預處理:將刺參腸去除內(nèi)容物、清洗，80~95°C加熱5~15min，冷卻、凍 干、粉碎，得到刺參腸凍干粉；
[0006] 所述加熱的目的在于除去海參腸內(nèi)源酶活力，阻止在原料貯藏過程中內(nèi)源酶對刺 參腸的降解作用，以保證原料品質(zhì)；
[0007] S2、以步驟S1制得的刺參腸凍干粉為底物，以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白 酶或風味蛋白酶中的一種為工具酶進行酶解反應(yīng)，酶解〇. 5~3h，將酶解液的pH調(diào)至中性， 80~95 °C加熱5~15min，終止酶解反應(yīng)，得到刺參腸酶解液；
[0008] S3、將步驟S2制得的刺參腸酶解液冷卻至室溫后于1500~2500 Xg離心10~ 30min，收集上清液，凍干、粉碎，得到刺參腸寡肽凍干粉；
[0009] S4、將步驟S3制得的刺參腸寡肽凍干粉與核糖共溶于水，得到混合溶液;所述混合 溶液中刺參腸寡肽終濃度為5~20mg/mL，所述核糖終濃度為所述刺參腸寡肽終濃度的0.5 ~2倍；
[0010] S5、向步驟S4制得的混合溶液中加入0.8~1 · 2mol/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7 · 0~ 9.0后，加熱至75~95 °C反應(yīng)2~6h; 0 °C冷卻，終止反應(yīng);將反應(yīng)液凍干、粉碎，得到高抗氧化 活性刺參腸寡肽衍生物。
[0011] 優(yōu)選方式下，步驟S1為將刺參腸去除內(nèi)容物、清洗，90 °C加熱lOmin;冷卻、凍干、粉 碎，得到刺參腸凍干粉。
[0012] 優(yōu)選方式下，步驟S2所述酶解反應(yīng)的具體操作為：
[0013] S21、采用凱式定氮法測定步驟S1制得的刺參腸凍干粉中的蛋白質(zhì)含量；
[0014] S22、以水為溶劑，稱取步驟S1制得的刺參腸凍干粉制備底物濃度（以蛋白質(zhì)計)為 4g/100mL的刺參腸蛋白水溶液；
[0015] 所述刺參腸凍干粉的量根據(jù)步驟S21測得的蛋白質(zhì)含量換算得到；
[0016] S23、向步驟S22制得的刺參腸蛋白水溶液中按2000~3000(U/g底物蛋白）加入所 述工具酶，調(diào)節(jié)溶液pH; 45~55°C酶解0 · 5~3h;
[0017] 所述工具酶為中性蛋白酶時，調(diào)節(jié)pH至7.0;所述工具酶為木瓜蛋白酶時，調(diào)節(jié)pH 至7.0;所述工具酶為堿性蛋白酶時，調(diào)節(jié)pH至8.5;所述工具酶為風味蛋白酶時，調(diào)節(jié)pH至 7.5。
[0018] 最優(yōu)方式下，步驟S2所述酶解反應(yīng)優(yōu)選采用堿性蛋白酶，酶加量為3000(U/g底物 蛋白），溫度為50°C，酶解時間為3h。
[0019] 優(yōu)選方式下，步驟S3所述離心分離條件為2000 X g離心20min。
[0020] 優(yōu)選方式下，步驟S4所述混合溶液中，刺參腸寡肽終濃度為10mg/mL，核糖終濃度 為20mg/mL。
[0021 ] 優(yōu)選方式下，步驟S5為向步驟S4制得的混合溶液中加入Imol/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié) pH至8.0，加熱至95 °C保持4h; 0 °C冷卻，終止反應(yīng);將反應(yīng)液凍干、粉碎，得到高抗氧化活性 刺參腸寡肽衍生物。
[0022]本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新在于：
[0023] 1、本發(fā)明方法以刺參加工過程中的副產(chǎn)物刺參腸為原料，提高了刺參加工過程中 副產(chǎn)物的利用率，使其蛋白資源得到充分開發(fā)利用，同時減少了刺參腸副產(chǎn)物對環(huán)境的污 染，對刺參腸資源的開發(fā)利用具有重要意義。
[0024] 2、本發(fā)明采用堿性蛋白酶作為優(yōu)選的蛋白酶，與現(xiàn)有的利用美拉德反應(yīng)制抗氧化 產(chǎn)品的技術(shù)相比，酶解反應(yīng)過程簡單有效?，F(xiàn)有技術(shù)中普遍采用三種或兩種酶混合作為酶 解用酶。
[0025] 3、本發(fā)明以NaOH替代磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，避免磷酸鹽溶液體系下核糖本身的 褐變反應(yīng)，最大程度的保證刺參腸寡肽與核糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，使其可以作為功能基料應(yīng) 用于食品中。
[0026] 4、本發(fā)明產(chǎn)品一一刺參腸寡肽衍生物即是刺參腸寡肽與核糖Maillard反應(yīng)后生 成的類黑精物質(zhì)，該物質(zhì)的抗氧化活性與寡肽和還原糖的種類有關(guān)。因此，本發(fā)明選取最利 于Maillard反應(yīng)的核糖為還原糖，并通過設(shè)計不同的蛋白酶及酶解時間，獲得不同種類的 刺參腸寡肽，以獲得抗氧化活性最強的刺參腸寡肽衍生物。此外，4h的Maillard反應(yīng)時間， 既保障了產(chǎn)品的高抗氧化能力，又提高了生產(chǎn)效率。
[0027] 5、本發(fā)明涉及的操作過程簡單，不需要復雜的設(shè)備，生產(chǎn)的刺參腸寡肽衍生物的 抗氧化活性高，IC5q(DPPH自由基半抑制率)可達到0.202mg/mL，生產(chǎn)率高，適用于工業(yè)化生 產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明方法的具體步驟為：
[0029] S1、刺參腸預處理:將刺參腸去除內(nèi)容物，清洗后于80~95°C加熱5~15min，冷卻、 凍干、粉碎，得到刺參腸凍干粉；
[0030] S2、以步驟S1所述的刺參腸凍干粉為底物，以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白 酶或風味蛋白酶中的一種為工具酶進行酶解，調(diào)pH至中性后立即于80~95 °C加熱5~15min 以終止酶解反應(yīng)，得到刺參腸酶解液。
[0031] 采用凱式定氮法測定刺參腸凍干粉中的蛋白質(zhì)含量，本實施例中涉及的刺參腸凍 干粉中蛋白質(zhì)的含量為61.13%(以干重計），制備底物濃度（以蛋白質(zhì)計)為4 8/10〇1^的刺 參腸蛋白水溶液時，需制備6.54g/100mL的刺參腸凍干粉懸濁液。
[0032]上述酶解反應(yīng)的酶解條件為：
[0033] 底物濃度（以蛋白質(zhì)計）：4g/100mL刺參腸蛋白水溶液;酶加量：3000(U/g底物蛋 白）；溫度：50 °C ;酶解時間：0 · 5~3h;
[0034] 以中性蛋白酶為工具酶進行酶解反應(yīng)時，酶解反應(yīng)的pH為7.0;
[0035] 以木瓜蛋白酶為工具酶進行酶解反應(yīng)時，酶解反應(yīng)的pH為7.0;
[0036] 以堿性蛋白酶為工具酶進行酶解反應(yīng)時，酶解反應(yīng)的pH為8.5;
[0037] 以風味蛋白酶為工具酶進行酶解反應(yīng)時，酶解反應(yīng)的pH為7.5。
[0038] S3、將步驟S2所述的刺參腸酶解液冷卻至室溫后1500~2500 Xg離心10~30min， 收集上清液，凍干、粉碎，得到刺參腸寡肽凍干粉；
[0039] S4、將步驟S3所述的刺參腸寡肽凍干粉與核糖共溶于水，配成混合溶液，制得的混 合溶液中刺參腸寡肽終濃度為5~20mg/mL，所述核糖終濃度為所述刺參腸寡肽終濃度的 0.5~2倍；
[0040] S5、向步驟S4制得的混合溶液中加入0.8~1.2mol/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0~ 9.0,加熱至75~95 °C保持2~6h，進行Mail lard反應(yīng);0°C冷卻，終止反應(yīng)，將反應(yīng)液凍干、粉 碎，得到高抗氧化活性刺參腸寡肽衍生物。
[0041 ] 實施例1
[0042] 1、將刺參腸去除內(nèi)容物，清洗后于90 °C加熱lOmin，冷卻至室溫后凍干、粉碎，得到 刺參腸凍干粉；
[0043] 2、以刺參腸凍干粉為底物，以中性蛋白酶為工具酶進行酶解，于90°C加熱lOmin終 止反應(yīng)，得到刺參腸酶解液。其中酶解條件為：
[0044]底物濃度（以蛋白質(zhì)計）：4g/100mL;酶加量:3000(U/g底物蛋白）；pH: 7.0;溫度:50 °C ;酶解時間：lh。經(jīng)測定，該刺參腸寡肽的IC5Q(DPPH自由基半抑制率)為2.053mg/mL;
[0045] 3、將刺參腸酶解液冷卻至室溫后于2500Xg離心15min，收集上清液，凍干、粉碎后 得到刺參腸寡肽凍干粉；
[0046] 4、制備刺參腸寡肽與核糖混合溶液，使兩者終濃度分別為10mg/mL和20mg/mL，肽 糖質(zhì)量比為1:2;
[0047] 5、向刺參腸寡肽與核糖混合溶液中加入Imol/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，加熱至 95°C保持4h進行Mai 1 lard反應(yīng)，0°C冷卻，終止反應(yīng)，將反應(yīng)液凍干、粉碎，得到高抗氧化活 性刺參腸寡肽衍生物。制得的高抗氧化活性刺參腸寡肽衍生物的IC5q(DPPH自由基半抑制 率)為0.26911^/1^，相較于刺參腸寡肽的1(： 5()，二者的比例為1:7.63。
[0048] 實施例2
[0049] 1、將刺參腸清洗去除內(nèi)容物，清洗后于95 °C加熱lOmin，冷卻至室溫后凍干、粉碎， 得到刺參腸凍干粉；
[0050] 2、以刺參腸凍干粉為底物，以堿性蛋白酶為工