結(jié)直腸癌的檢測引物、方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領域，具體涉及一種CA4基因的檢測引物、試劑盒及試 劑盒的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤死因的第三 位，臨床上結(jié)腸癌外科手術(shù)治療失敗的主要原因是術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移，尤其是肝轉(zhuǎn)移。因此， 對結(jié)腸癌預后因素的分析有助于確定有術(shù)后復發(fā)可能的高危個體，篩選影響結(jié)腸癌患者術(shù) 后復發(fā)的獨立指標，為臨床選擇更合適的治療方案。
[0003] 傳統(tǒng)的術(shù)后篩查方法包括糞便潛血試驗、糞便免疫試驗、結(jié)腸鋇劑灌腸檢查、乙狀 結(jié)腸鏡檢查及結(jié)腸鏡檢查等等。其中，糞便潛血試驗和糞便免疫試驗具有一定的特異性和 靈敏性，但前提是患者已存在明顯的腫瘤大小，因此不適用于結(jié)直腸癌復發(fā)的早期檢測。內(nèi) 窺鏡檢查是目前結(jié)直腸癌篩查的最好方法，但由于這種方法具有侵入性、易產(chǎn)生并發(fā)癥等 缺陷限制了其在普查篩選中的應用。因此，現(xiàn)今對結(jié)腸癌預后的診斷，均是以臨床、病理學 和影像學信息為基礎，仍處于經(jīng)驗性判準的階段，遠遠不能適應對結(jié)直腸癌有復發(fā)風險的 高危人群的篩查和診斷的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種通過檢測結(jié)直腸癌 預后復發(fā)的生物標記物CA4基因甲基化，進而實現(xiàn)結(jié)直腸癌的檢測引物、試劑盒及方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術(shù)方案如下：
[0006] -種CA4基因的檢測引物，所述CA4基因的檢測引物包括甲基化擴增引物；其中， 所述甲基化擴增引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的上游引物CA4-MF和具有序 列表SEQ. ID. No. 2喊基序列的下游引物CA4-MR ;
[0007] 和/或，所述CA4基因的檢測引物包括BGS引物；其中，所述BGS引物包括具有序 列表SEQ. ID. No. 5堿基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ. ID. No. 6堿基序列的下 游引物CA4-BR。
[0008] 采用本發(fā)明的檢測引物，基于CA4基因這一生物標記物進行，通過提取并擴增CA4 基因后擴增，并檢測擴增產(chǎn)物中CA4基因甲基化狀態(tài)，則可進一步輔助結(jié)直腸癌以及復發(fā) 的可能性檢測；相比現(xiàn)有的檢測方法具有非侵入性、樣品收集方便靈活等特點。
[0009] 本發(fā)明進一步提出一種采用上述引物的試劑盒，以及使用該試劑盒進行CA4基因 檢測的方法。
[0010] 采用本發(fā)明的方法，其實過程中基于試劑盒中的基于CA4基因的檢測引物實施， 其目的在于CA4基因這一結(jié)直腸癌生物標記物進行，通過提取并擴增CA4基因后擴增，并檢 測擴增產(chǎn)物中CA4基因甲基化狀態(tài)，則可進一步輔助結(jié)直腸癌以及復發(fā)的可能性檢測；相 比現(xiàn)有的檢測方法具有非侵入性、樣品收集方便靈活等特點。
【附圖說明】
[0011] 下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0012] 圖1為本發(fā)明實施例CA4在結(jié)腸癌細胞系中mRNA的表達水平檢測示意圖；
[0013] 圖2為本發(fā)明實施例CA4在成對的結(jié)腸癌和癌旁組織中的相對表達量對比示意 圖；
[0014] 圖3為本發(fā)明實施例外源性CA4在裸鼠腫瘤細胞中的表達的影響示意圖；
[0015] 圖4為本發(fā)明實施例去甲基化試劑對CA4表達的影響7K意圖；
[0016] 圖5為本發(fā)明實施例檢測的CA4基因啟動子的CpG島的識別結(jié)果圖；
[0017] 圖6為本發(fā)明實施例腫瘤和正常結(jié)腸組織中CA4基因甲基化水平對比示意圖；
[0018] 圖7為本發(fā)明實施例腫瘤和正常結(jié)腸組織中CA4基因甲基化水平示意圖；
[0019] 圖8為本發(fā)明實施例對結(jié)腸癌患者預后復發(fā)的Kaplan-Meier分析曲線。
【具體實施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明實施例提供一種CA4基因的檢測方法，包括如下步驟：
[0022] S10,獲取待測標樣；
[0023] S20,提取待測標樣中包含CA4基因的基因組DNA ;
[0024] S30,對提取的基因組DNA用亞硫酸氫鈉進行處理修飾；
[0025] S40,將處理修飾后的基因組DNA進行PCR擴增，并檢測擴增產(chǎn)物中CA4基因的甲 基化水平。
[0026] 本發(fā)明通過針對以CA4基因作為結(jié)直腸癌預后復發(fā)大量篩查的生物標記物，采用 將上述方式中采用對待測標樣的基因組DNA中的CA4基因的進行擴增，并驗證CA4基因的 甲基化水平，實現(xiàn)間接輔助結(jié)直腸癌預后復發(fā)大量篩查。
[0027] 其中在本發(fā)明中，采用的待測標樣可以選結(jié)直腸癌細胞等樣本，然后提取其中含 有CA4基因的基因組DNA，并對基因組DNA進行擴增；其中基因組DNA提取過程可以采用試 劑盒進行，其操作過程可以采用QIAGEN公司的基因組DNA提取試劑盒，操作參照試劑盒進 行。提取完成之后利用分光光度計測量DNA的濃度及純度，選擇濃度和純度較好的樣本DNA 進行PCR擴增。
[0028] 同時，步驟S30中采用亞硫酸氫鈉對提取的基因組DNA進行處理修飾，基因組DNA 的亞硫酸氫鈉修飾使用Zymo Research公司的EZ DNA methylation-gold kit,操作參照試 劑盒推薦方法進行。采用亞硫酸氫鈉鹽的修飾處理可以使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫 氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，在PCR擴增所需片段時因為尿嘧啶會全 部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，那么最后可以將擴增得到的產(chǎn)物DNA進行分析，與未發(fā)生甲基化的正 常序列對比，則可以最終判斷是否發(fā)生了甲基化，以及甲基化發(fā)生的程度。
[0029] 因此在上述步驟S30亞硫酸氫鈉鹽的處理之后，步驟S40通過對修飾后的基因組 DNA進行PCR擴增，并檢測擴增產(chǎn)物中CA4基因的甲基化水平，該步驟的實現(xiàn)可以通過如下 三種方式進行：
[0030] S40a，MSP法：采用具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的上游引物CA4-MF和具有 序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物CA4-MR，對所提取的基因組DNA進行擴增；擴增 過程中，處理修飾后的DNA為模板，采用上述引物，聯(lián)合DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP、 去離子水混合，進行PCR擴增。
[0031] 其中，在本發(fā)明步驟S40a實施過程中，在甲基化引物進行陽性擴增的基礎上， 還可以另外增加非甲基化引物作為進行陰性對照，非甲基化引物對包括具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列的上游引物CA4-UF和具有序列表SEQ. ID. No. 4堿基序列的下游引物 CA4-UR。
[0032] 上述擴增結(jié)束之后，取10 μ 1 PCR產(chǎn)物，以DL2000為標準分子量，用1. 5%瓊脂糖 凝膠電泳檢測并拍照。通過雙重擴增的結(jié)果，如果甲基化引物擴增陽性，非甲基化引物擴增 陰性，那表明結(jié)果為CA4基因發(fā)生完全甲基化；如果甲基化引物和非甲基化引物擴增均出 現(xiàn)陽性條帶，表明結(jié)果為CA4基因發(fā)生部分甲基化，結(jié)果仍然視為陽性；如果甲基化引物擴 增陰性，非甲基化引物擴增陽性，則表明CA4基因未發(fā)生甲基化。根據(jù)上述三種情形所獲得 的CA4基因甲基化狀態(tài)，則可進一步確定病人患有結(jié)直腸癌以及復發(fā)的可能性。
[0033] S40b，BGS法：即硫化基因序列測序反應法，以步驟S30修飾后的DNA為模板，利用 具有序列表SEQ. ID. No. 5堿基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ. ID. No. 6堿基序 列的下游引物CA4-BR進行擴增，然后將擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果經(jīng)Edit sequencing 軟件分析CA4甲基化情況，并且與未經(jīng)亞硫酸氫鈉鹽處理的擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果比對，通 過比對中甲基化的狀態(tài)便可以的進一步確定病人患有結(jié)直腸癌以及復發(fā)的可能性。
[0034] S40c，COBRA法：即COBRA大批量檢測結(jié)直腸癌組織中CA4甲基化狀態(tài)，采用BGS引 物即具有序列表SEQ. ID. No. 5堿基序列的上游引物CA4-BF和具有序列表SEQ. ID. No. 6堿 基序列的下游引物CA4-BR進行擴增；之后將PCR產(chǎn)物經(jīng)BstUI酶處理，60°C酶切過夜。第 二日將反應后的混合液，以DL2000為標準分子量，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。
[0035] 結(jié)果判定標準：①樣品除外在原有大小位點的條帶外，其余位點有酶切后形成的 不同大小片段的一條或一條以上條帶即為甲基化陽性；②樣品除外在原有大小位點條帶 外，完全沒有其余酶切后形成的條帶即視為甲基化陰性。
[0036] 采用本發(fā)明的檢測方法，基于CA4基因這一生物標記物進行，通過提取并擴增CA4 基因后檢測CA4基因甲基化狀態(tài)，則可進一步確定病人患有結(jié)直腸癌以及復發(fā)的可能性。 相比現(xiàn)有的檢測方法，具有非侵入性、樣品收集方便靈活等特點。
[00371

[0038] 為使本發(fā)明上述方法過程中CA4基因作為生物標記，進行檢測的過程實施細節(jié)更 加清楚完整、易于本領域技術(shù)人員的實施參考，以及使本發(fā)明的突出的進步性效果更加顯 著，以下通過實施例對上述過程的實施進行具體的驗證說明。
[0039] 實施例1
[0040] 結(jié)直腸癌中CA4的表達下調(diào)試驗：
[0041] 利用 Trizol 法提取細胞總 RNA 并經(jīng) A