一種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥突變位點(diǎn)的引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及艾滋病病毒耐藥突變位點(diǎn)的檢測，尤其涉及 一種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥突變位點(diǎn)的引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病自1981年發(fā)現(xiàn)以來，迅速在全世界蔓延，已成為危害人類健康的重大公共 衛(wèi)生問題。據(jù)UNAIDS報(bào)道，截至2014年，全球存活的艾滋病病毒感染者和病人約3670萬，其 中2014年新發(fā)感染200萬例。
[0003] 高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療已廣泛應(yīng)用于艾滋病患者的臨床治療，目前約有1560萬艾 滋病病毒感染者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，極大地提高了患者的生存率。然而，抗病毒治療的 人數(shù)及地區(qū)的快速擴(kuò)大也導(dǎo)致艾滋病耐藥毒株的傳播和流行。我國不同地區(qū)抗病毒治療人 群耐藥發(fā)生率從3 %到56 %不等。
[0004] 對(duì)于艾滋病初治患者，抗病毒治療方案為2種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)+l種 非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)或2種NRTIs+Ι種蛋白酶抑制劑(PIs)，分別以HIV病毒 P〇l基因上的逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶為靶標(biāo)。艾滋病的耐藥發(fā)生在艾滋病病毒P〇l基因上，主要 分為NRTIs耐藥突變、NNRTIs耐藥突變和Pis耐藥突變。其中NRTIs藥物有齊多夫定、拉米夫 定、扎西他濱等，可誘導(dǎo)產(chǎn)生K65R、M184、T215Y等耐藥突變。
[0005] 病毒耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一，采用經(jīng)濟(jì)高效的耐藥檢測方法，及時(shí) 了解HIV治療患者的耐藥性，對(duì)于提高艾滋病治療效果和控制艾滋病疫情有重要意義。
[0006] 目前臨床上廣泛使用的耐藥檢測方法是基于測序的基因型檢測，包括直接測序 法、克隆測序分析、連續(xù)特異性擴(kuò)增分析、深度焦磷酸測序等。這些方法雖然操作較為簡單， 但缺點(diǎn)明顯，如檢測時(shí)間長、費(fèi)用高等。
[0007] 等位基因特異性PCR(ASPCR)是一種快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測單堿基突變的技術(shù)。 它通過設(shè)計(jì)三條引物，其中一條為通用引物，另外兩條為特異性平行引物，引物的3'末端分 別與突變位點(diǎn)配對(duì)或錯(cuò)配。進(jìn)行PCR時(shí)，模板正確匹配的引物正常擴(kuò)增，而與模板錯(cuò)誤配對(duì) 的引物沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，從而確定序列的基因型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是使用ASPCR技術(shù)，針對(duì)主要的NRTIs耐藥突變?cè)O(shè)計(jì)特異性引物，提 供一種快速、靈敏、低成本的檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥突變位 點(diǎn)的引物及其應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0010] -種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要耐藥突變位點(diǎn)的引物，包括 檢測 HIV-ι 病毒 pol 基因的突變位點(diǎn) M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、 T215Y和T215F的ASPCR引物，每個(gè)突變位點(diǎn)均包括一對(duì)野生型PCR擴(kuò)增引物及一對(duì)突變型 PCR擴(kuò)增引物，每對(duì)野生型PCR擴(kuò)增引物或突變型PCR擴(kuò)增引物均包括一條特異性上游引物 和一條通用下游引物；
[0011] 對(duì)于M41L位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID N0.1 和SEQ ID NO.21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.21；
[0012] 對(duì)于D67N位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.21；
[0013]對(duì)于K65R位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.21；
[0014] 對(duì)于K70R位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.7 和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.21；
[0015] 對(duì)于K70E位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO.9 和SEQ ID NO.21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO.21；
[0016] 對(duì)于M184V位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 12 和SEQ ID NO.21;
[0017] 對(duì)于M184I位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 14 和SEQ ID NO.21;
[0018] 對(duì)于L210W位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 16 和SEQ ID NO.21;
[0019] 對(duì)于T215Y位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 18 和SEQ ID NO.21;
[0020] 對(duì)于T215F位點(diǎn)，其野生型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 21，其突變型PCR擴(kuò)增引物的上游引物和下游引物分別為SEQ ID NO. 20 和SEQ ID NO.21。
[0021] 所述的HIV-1病毒pol基因?yàn)镾EQ ID NO.22所示的核苷酸序列。
[0022] 本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述的引物在檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐 藥突變位點(diǎn)中的應(yīng)用，所述的耐藥突變位點(diǎn)為M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、 L210W、T215Y和T215F。
[0023] 所述的引物用于檢測HIV-1病毒NRTI耐藥突變位點(diǎn)M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、 1184￥、11841丄2101、了215￥和了215?的43?〇?檢測方法，具體步驟為 :將耐藥突變位點(diǎn)相應(yīng)的 引物以待檢測樣品的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)real-time PCR檢測的反應(yīng)體系共 20uL，其中2X SYBR Green PCR Master Mix 10uL，上游引物和下游引物各0.4uL，待檢樣品 cDNA模板2uL，ddH20 7.2uL;反應(yīng)程序?yàn)椋孩兕A(yù)變性95°C lmin，②然后95°C lOsec，退火62°C 30sec，延伸72°Clmin，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，③以每5秒升高0.5°C的速度，從60°C升至95°C，獲得 產(chǎn)物的特異性溶解峰;根據(jù)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)CT值判定結(jié)果，當(dāng)CT值 小于等于33時(shí)，待測樣品中含有擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)的基因型，當(dāng)CT值大于35時(shí)，待測樣品中不含 擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)的基因型。
[0024]本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)。設(shè)計(jì)的ASPCR引物只針 對(duì)特定位點(diǎn)堿基突變序列，能特異性擴(kuò)增突變模板，檢測基因突變靈敏度可以達(dá)到10 % (即 目的基因的突變基因 RNA模板數(shù)占野生型RNA模板數(shù)的10% )，能有效檢測艾滋病低豐度耐 藥，克服了基因型檢測方法實(shí)驗(yàn)周期長、檢測豐度高的缺點(diǎn)。本發(fā)明只涉及real-time PCR 檢測這一常見方法，易于掌握，操作快速，根據(jù)PCR的擴(kuò)增曲線和CT值即可判斷基因類型。
【附圖說明】
[0025] 圖1是實(shí)施例2所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0026] 圖2是實(shí)施例3所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0027] 圖3是實(shí)施例4所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0028] 圖4是實(shí)施例5所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0029] 圖5是實(shí)施例6所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0030] 圖6是實(shí)施例7所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0031] 圖7是實(shí)施例8所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0032] 圖8是實(shí)施例9所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0033] 圖9是實(shí)施例10所述的檢測結(jié)果示意圖。
[0034] 圖10是實(shí)施例11所述的檢測結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案和獲得的