一種基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基于Maillard反應(yīng)機(jī)理的蛋白質(zhì)和多糖糖基化研究是蛋白質(zhì)化學(xué)改性的一種綠色有效方法，因其具有較高的接枝度和安全性而廣泛在食品工業(yè)中應(yīng)用。蛋白質(zhì)和多糖是共存于食品乳化體系中最重要的兩類生物大分子，是影響食品結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)的主要因素。蛋白質(zhì)因能在液液或氣液界面上形成吸附層來降低界面張力而多在膠體體系中充當(dāng)乳化劑，多糖則由于其良好的增稠和持水特性而常用做穩(wěn)定劑，由此賦予了體系不同于兩者單獨(dú)存在時(shí)的功能表現(xiàn)。共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)與多糖形成大分子復(fù)合物(conjugates)，既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能，與蛋白質(zhì)多糖弱相互作用形成的混合物(complex)對比，對環(huán)境條件(溫度、pH值、離子強(qiáng)度等)具有較高的適應(yīng)性。通過自發(fā)的Mai I Iard反應(yīng)生成的糖基化蛋白溶解性、乳化性、凝膠特性、抗氧化性、抗菌性以及熱穩(wěn)定性等性能均有提高。該研究是目前國內(nèi)外對于功能性添加劑的新的研究領(lǐng)域。
[0003]可溶性大豆多糖(Soybean soluble polysaccharides)是從豆制品加工的副產(chǎn)物豆渣中提取的水溶性多糖。是一種綠色食品添加劑。SSPS是一種酸性多糖，半乳糖醛酸主鏈上分布著阿拉伯糖中性側(cè)鏈，結(jié)構(gòu)類似于果膠，具有高溶解性、抗氧化性、較低粘性以及乳化穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性。SSPS作為食品領(lǐng)域天然的抗氧化劑、防腐劑和增稠劑，對酸性乳飲料的穩(wěn)定劑中的應(yīng)用具有重要的學(xué)術(shù)意義。此外，SSPS還具有調(diào)節(jié)血糖值和血液脂質(zhì)、促進(jìn)腸道有害物質(zhì)的吸附與排泄、抗癌、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收利用等生物活性。工業(yè)生產(chǎn)中，豆渣不能被進(jìn)一步利用，被當(dāng)作廢棄物扔掉，造成環(huán)境負(fù)擔(dān)和浪費(fèi)。SPSS的提取提高了豆渣利用率，降低成本，保護(hù)環(huán)境。
[0004]SSPS突出的分散穩(wěn)定性是目前食品行業(yè)中應(yīng)用的熱點(diǎn)。SSPS在酸性條件下具有良好的分散穩(wěn)定性，能夠達(dá)到穩(wěn)定低粘度的乳酸飲料效果，這種現(xiàn)象主要是由于SSPS中性糖側(cè)鏈的空間位阻作用以及液滴通過多糖分子被聯(lián)結(jié)在一起，形成所謂的橋連絮凝，隨著可溶性大豆多糖濃度的增加，多糖可以完全覆蓋蛋白質(zhì)包被的液滴，使液滴表面帶上凈負(fù)電荷，液滴因靜電排斥來使蛋白液滴穩(wěn)定。所以利用SSPS來穩(wěn)定酸性乳飲料具有很好的發(fā)展前景。但是，作為弱相互作用所得到的產(chǎn)品性能始終不能很好地經(jīng)受儲存期的考驗(yàn)，所以一般市面上的酸性乳飲料市場貨架期都不長，長時(shí)間放置底部會出現(xiàn)少量蛋白沉淀等現(xiàn)象。SSPS能夠很好的在酸性條件下穩(wěn)定蛋白，如果與蛋白能夠發(fā)生糖基化共價(jià)接枝，得到的共價(jià)復(fù)合物在蛋白等電點(diǎn)區(qū)域(PH4.6?5.0)的各種物化性能將得到突破性的提升，在此基礎(chǔ)上得到糖基化產(chǎn)物能夠更好地改善SSPS的市場應(yīng)用預(yù)期。此外，關(guān)于蛋白的糖基化研究也是食品行業(yè)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，目前國內(nèi)外該項(xiàng)研究所涉及的多糖都為中性多糖如葡聚糖，以及其他小分子的多糖，未能達(dá)到糖基化蛋白在酸性條件下完全可溶的理想效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種基于可溶性大?多糖的糖基化蛋白的制備方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過上述方法制備得到的基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。
[0007]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]—種基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下制備步驟:
[0009](I)將蛋白和可溶性大豆多糖分別溶解于去離子水中，攪拌I?2h，調(diào)整溶液pH值為6.8?7.0，分別得到蛋白儲液和多糖儲液，將兩者攪拌混合均勻后過夜水化，然后凍干得到混合物；
[0010](2)將凍干后的混合物在溫度為60°C，濕度為79%的干燥器中反應(yīng)7?14天，得到反應(yīng)產(chǎn)物；
[0011](3)將步驟(2)所得反應(yīng)產(chǎn)物溶解于去離子水中，攪拌0.5?2h，調(diào)整溶液pH值為4.6?5.0，然后將溶液離心，將上清液干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。
[0012]所述的蛋白包括大豆分離蛋白、豌豆蛋白或乳清蛋白等。
[0013]所述調(diào)節(jié)溶液pH值優(yōu)選采用0.1N HCl或0.1N NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0014]所述蛋白儲液和多糖儲液中所含蛋白或多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為10%。
[0015]所述的蛋白儲液和多糖儲液混合后，所含蛋白和可溶性大豆多糖的質(zhì)量比優(yōu)選為1:(1 ?5)0
[0016]步驟(3)中所述反應(yīng)產(chǎn)物溶解于去離子水中的質(zhì)量比優(yōu)選為1:20。
[0017]所述的離心優(yōu)選在I OOOOrpm下離心15?30min。
[0018]所述的干燥是指采用冷凍干燥、噴霧干燥或者真空干燥。
[0019]—種基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白，通過以上方法制備得到。
[0020]植物蛋白和糖的糖基化接枝改性反應(yīng)是基于蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基和糖分子還原末端的羰基之間的羰氨反應(yīng)，即Maillard反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行的。對于復(fù)雜的Mai I Iard反應(yīng)階段來說，具有功能特性的接枝產(chǎn)物一般是形成在Mai I Iard反應(yīng)的初級階段末期或者中期，高級階段形成功能差的棕黃色或黑色物質(zhì)一類黑素，因此在反應(yīng)過程中選擇結(jié)合SDS-PAGE圖譜，利用考馬斯亮蘭和品紅試劑分別用于染色蛋白譜帶和糖蛋白譜帶，通過對比產(chǎn)物中有無添加巰基乙醇的情況下進(jìn)行電泳后圖譜的變化來鑒定共價(jià)鍵的大分子復(fù)合物的形成；選擇利用反應(yīng)物在可見區(qū)420nm處有吸收，顯示高級階段產(chǎn)物生成的程度。
[0021]本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0022]本發(fā)明基于美拉德反應(yīng)制備的糖基化接枝產(chǎn)物具有較高的接枝度，SSPS具有優(yōu)越的分散穩(wěn)定性，特別在酸性條件下能夠很好穩(wěn)定蛋白分子，進(jìn)一步與蛋白發(fā)生共價(jià)接枝可以準(zhǔn)確地達(dá)到修飾蛋白分子在酸性條件下分子穩(wěn)定的效果，同時(shí)得到功能性優(yōu)越的蛋白多糖大分子產(chǎn)物，有效提高蛋白在等電點(diǎn)附近的功能性質(zhì)，尤其乳化性，熱穩(wěn)定性及發(fā)泡性等優(yōu)于二者的混合作用，具有良好的市場前景。
【附圖說明】
[0023 ]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中SPI和SSPS干熱不同反應(yīng)時(shí)間蛋白質(zhì)的電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0025]實(shí)施例1
[0026](I)將大豆分離蛋白6.25g(實(shí)驗(yàn)室自$1」，蛋白含量為80%)和可溶性大豆多糖5g(福建味博食品有限公司)分別溶解于去離子水中，攪拌lh，采用0.1N HCl和0.1N NaOH調(diào)整溶液PH值為6.8，分別得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的蛋白儲液和多糖儲液，將兩者攪拌2h混合均勻后過夜水化，然后凍干得到混合物；
[0027](2)將凍干后的混合物在溫度為60°C，濕度為79%的干燥器中反應(yīng)7天，得到反應(yīng)產(chǎn)物；
[0028](3)將步驟(2)所得反應(yīng)產(chǎn)物溶解于20倍質(zhì)量的去離子水中，攪拌2h，采用0.1NHCl調(diào)整溶液pH值為4.8，然后將溶液在室溫下1000rpm下離心15min，上清液經(jīng)冷凍干燥得到基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白。所得糖基化蛋白在酸性條件(PH4.6?5.0)完全可溶，具有良好的功能特性。大豆分離蛋白與可溶性大豆多糖1:1干熱制備的共價(jià)復(fù)合物乳化活性(EAI)進(jìn)一步增加，與大豆分離蛋白相比提升了約181.7%。
[0029]本實(shí)施例的大豆分離蛋白通過如下方法制備:
[0030]低溫脫脂豆柏粉碎后溶于蒸餾水(1: 10，w/v)，用2N NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，室溫緩慢攪拌2h，豆渣過4層紗布后，離心(8000g，20min，25°C )，在上清液中加入2N HCl調(diào)節(jié)溶液pH至4.5，4 °C靜置0.5h后離心(8000g，20min，25 °C )，沉淀用清水清洗表面多次以去除殘留的清蛋白。取出沉淀，記錄濕重，分散于濕重7倍的純水中，緩慢攪拌(切記用轉(zhuǎn)子劇烈攪拌)，然后調(diào)節(jié)PH至7.5，純水透析48h，期間換3次水，凍干備用。
[0031]本實(shí)施例中大豆分離蛋白(SPI)和可溶性大豆多糖(SSPS)干熱接枝及證明的相關(guān)試驗(yàn):
[0032]SDS-PAGE 分析方法:
[0033]依據(jù)Laemmli的方法進(jìn)行SDS-PAGE。將步驟(3)所得樣品置入樣品緩沖液中[0.125mol/L Tris-HCl緩沖液，含l%SDS(w/v)，5%甘油(v/v)，2%2_巰基乙醇