一種海馬催產(chǎn)劑及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學和分子生物學領(lǐng)域，具體設(shè)及一種海馬催產(chǎn)劑及其編碼基 因。
【背景技術(shù)】：
[0002] 脊椎動物的生殖活動主要由"腦/下丘腦-腦垂體-性腺"的生殖軸（brain- pituitary-gonad axis, BPG軸）調(diào)控。腦/下丘腦分泌產(chǎn)生促性腺激素釋放激素 (gonadotropin releasing hormone,Gn畑），刺激腦垂體促性腺激素（gonadotropin,G地）， 包括促黃體生成激素 (Xuteinizing Hormone ,LH)與促濾泡激素 （Follicle stimulating hormone, FSH)的合成與釋放，促性腺激素作用于性腺，增加性腺性類固醇激素的生成與分 泌，進而促進性腺發(fā)育成熟、配子生成與排放。而位于生殖軸（GnRH-GtH軸）上游的的基 因--Kisspeptin，由kiss基因編碼，經(jīng)翻譯后斷裂修飾產(chǎn)生包括Kissp邱tin-10的酷胺化 短膚。研究已經(jīng)證實:Kisspeptin通過激活GnRH神經(jīng)元，刺激G地分泌，對調(diào)控生殖的"腦/下 丘腦-腦垂體-性腺"軸起著直接的刺激作用，運一發(fā)現(xiàn)被認為是近年來生殖生理學研究的 一個主要突破。
[0003] 目前，魚類人工繁殖中常用的催產(chǎn)劑有Ξ種：即絨毛膜促性腺激素化CG)、促黃體 生成素釋放激素類似物化畑-A)和魚類的腦下垂體(PG)。但運些傳統(tǒng)的催產(chǎn)劑只對淡水魚 類催產(chǎn)效果較好，而對海水魚類沒有明顯的效果，表明不同種類的親魚對不同催產(chǎn)劑的敏 感性有很大差異。
[0004] 海馬是海龍科海馬屬（Syngnathidae Hippocampus spp.)所有魚類的統(tǒng)稱，是珍 稀的海洋藥源動物，在我國素有"南方人參"之稱，具有極高的經(jīng)濟價值，是一種高檔的中藥 材。由于過度捕拱和環(huán)境污染等因素，生態(tài)環(huán)境破壞嚴重，使得海馬的自然資源急劇下降， 目前已被列為海洋溯危動物。加強人工養(yǎng)殖是有效減緩海馬自然資源被捕拱的壓力和滿足 市場對海馬的需求。目前，海馬的人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)處于發(fā)展初期，還沒能實現(xiàn)低成本大規(guī)模養(yǎng) 殖W滿足市場需求。解決苗種繁育是實現(xiàn)海馬養(yǎng)殖規(guī)?；年P(guān)鍵，了解并掌握海馬催產(chǎn)技 術(shù)是人工育苗關(guān)鍵技術(shù)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高效的海馬催產(chǎn)劑及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明的海馬催產(chǎn)劑，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 本發(fā)明的海馬催產(chǎn)劑的編碼基因-線紋海馬kiss2基因，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其含有37化p堿基，編碼123個氨基酸，N端前15aa為信號膚，且其N端第88個氨基 酸為斷裂位點（GKP);線紋海馬kiss2基因同樣具有十分保守的核屯、十膚（圖1陰影部分標 注），其序列為FNVNPFGLRF(圖1)。過收集雌雄海馬的腦、觸、肝、腸、腎、肌肉、育兒袋、皮膚、 精巢、卵巢等組織，提取RNA，運用巧光定量PCR檢測線紋海馬kiss2基因在各組織中的mRNA 表達情況。如圖4所示，線紋海馬kiss2基因的mRNA表達極為廣泛，在我們所收集的組織中均 能檢測到，在腦和卵巢中的表達豐度最高。通過人工合成線紋海馬kiss2基因的核屯、十膚 (FNVNPFGLRF，代號Kiss2-10)，WlOOng/gbw的濃度對線紋海馬進行腹腔注射，分別在3和6 小時后收集下丘腦、垂體樣品，提取RNA，用巧光定量PCR分別檢測其配體GPR54、sGn畑和FSH 的基因表達變化。如圖5所示，lOOng/gbw的kiss2-10處理化和化后，下丘腦GPR54和sGn畑的 表達沒有顯著變化，而垂體促濾泡激素(FSH)的表達量在多膚刺激化和化后都顯著的升高， 表明kiss2-10膚能激活垂體促性腺激素(GtH)，參與海馬的生殖調(diào)控。如圖6所示:kiss2-10 注射后化，血清中睪酬的含量沒有顯著變化;注射后化后，血清中睪酬的含量有個顯著的升 高，表明kiss2-10可W促進下游性腺性類固醇激素的分泌。
[000引本發(fā)明還提供一種多膚，其特征在于，其氨基酸序列為:FNVNPFGLRF。
[0009] 本發(fā)明還提供一種激活垂體分泌促濾泡激素或促進性腺性類固醇激素的分泌的 藥物，其特征在于，含有上述海馬催產(chǎn)劑或多膚，所述的多膚的氨基酸序列為:FNVNPFGLRF。
[0010] 本發(fā)明從線紋海馬中分離得到一種新的海馬催產(chǎn)劑，其能激活垂體分泌促濾泡激 素和促進性腺性類固醇激素的分泌，從而參與海馬的生殖調(diào)控，為解決海馬苗種繁育提供 了條件，有利于海馬養(yǎng)殖規(guī)模化的實現(xiàn)。
【附圖說明】：
[0011] 圖1是線紋海馬kiss2基因的cDNA序列和推導出的蛋白序列，信號膚部分用下劃線 標示，斷裂位點用箭頭表示，核屯、十膚區(qū)域用灰色陰影部分標注。
[0012] 圖2是硬骨魚類kisspeptin的氨基酸多重比對，核屯、十膚用方框表示，斷裂位點用 箭頭表示，其中kiss2_Seahorse代表本發(fā)明的海馬催產(chǎn)劑(線紋海馬KISS2)。
[0013] 圖3是Kissp邱tin系統(tǒng)進化樹。通過ClustalX 2.0比對各物種kissp邱tin氨基酸 序列，并使用MEGA 6.0軟件中的鄰近發(fā)構(gòu)建進化樹（Neighbor-Joining)，自展值 (bootstrap)為1000。進化樹中選取的相關(guān)物種及其基因在的GenBank的序列號為：Human kissl(NP_002247.3)；Pig kissl(ACH68409.1)；Mouse kissl(AAI17047.1)；Bovine kissl (BAM28696.1)；Xenopus kissl(ACJ50538.1)；Zebrafish kissl(ABV03802.1)；Seabass kissl(ACM07422.1)；Zebrafish kiss2(NP_001136057.1)；Medaka kiss2(NP_ 001153913.l)；Takifugu kiss2(BAJ15497.1)；Grouper kis2(ACT65993.1)；Seabass kiss2(ACM07423.1)，其中kiss2 Seahorse代表本發(fā)明的海馬催產(chǎn)劑(線紋海馬KISS2)。
[0014] 圖4是線紋海馬kiss2基因的mRNA在雌雄海馬各組織中表達模式。
[001引圖5是kiss2-10膚腹腔注射3小時和6小時后對海馬下丘腦GPR54和sGnRHW及垂體 F細的mRNA表達影響，*表示顯著差異（p<0.05)，圖中的Kiss-2代表kiss2-10膚，而對照組 control代表不注射ki