一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的改性低聚殼聚糖及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的改性低聚 殼聚糖及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖是甲殼素脫乙酷基的產(chǎn)物，是堿性多糖，也是少數(shù)帶電荷的天然產(chǎn)物之一， 具有廣譜抑菌、增強機體免疫力、提高動物生產(chǎn)性能、改善動物肉質(zhì)及凈化水質(zhì)的作用，并 且來源廣泛，無毒無害、無殘留、無耐藥性，安全又高效，是一種極具開發(fā)價值的飼料添加 劑。
[0003] 殼聚糖對大腸桿菌、金色葡萄球菌和綠濃桿菌及白色念球菌等多種細菌均有明顯 的抑制和殺滅作用，表現(xiàn)出較強的抗菌活性。但與已有的化學(xué)合成抗菌劑相比，抗菌活性依 然較低且對真菌類基本上沒有抑制活性，另外殼聚糖的抑制作用也因分子量的增大而減 弱，運與殼聚糖分子量越大，水溶性越差有關(guān)，從而導(dǎo)致抑菌性減弱。
[0004] 因此目前需要對殼聚糖結(jié)構(gòu)上的C2-N也和C6-OH進行化學(xué)改性，來增強制備產(chǎn)物的 溶解性并同時增加抑菌活性中屯、，從而制備一種新型具有多抗菌活性中屯、的抑菌劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個方面提供了一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的改性低聚殼聚糖，所述改性低聚 殼聚糖為低聚殼聚糖上至少接枝贓嗦二酬酸和季錠鹽。
[0006] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述改性低聚殼聚糖的重均分子量為3000~50000。
[0007] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述贓嗦二酬酸與低聚殼聚糖的接枝率為1~5%。
[000引在一種優(yōu)選的實施方式中，所述贓嗦二酬酸選自
[0009] A:
[0013] 中的一種或兩種。
[0014] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述贓嗦二酬酸A與B摩爾比為(0.3~0.5): 1。
[0015] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述季錠鹽與低聚殼聚糖的接枝率為1~5%。
[0016] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述季錠鹽選自
任意一種或多種，式中，X為Cl、B;r、I中的任意一種;η為2~13中的任意一個整數(shù)。
[0021 ] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述季錠鹽C與D、Ε、F之間摩爾比為(0.1~0.2): (0.2 ~0.3):(0.5~0.7):1。
[0022] 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述季錠鹽C與D、E、F之間摩爾比為（0.12~0.18): (0.24~0.28):(0.55~0.66):1。
[0023] 本發(fā)明的第二個方面提供了一種改性低聚殼聚糖的制備方法，所述方法包括下述 步驟：
[0024] (1)按重量份將重均分子量在3000~50000的低聚殼聚糖浸入2V 2^%醋酸溶液 和2V 5wt%的過氧化氨溶液中；
[0025] (2)將贓嗦二酬酸溶解于10V甲醇中，再加入到所述步驟（1)得到的低聚殼聚糖溶 液中，得到反應(yīng)液；
[0026] (3)將所述步驟(2)中得到的反應(yīng)液用lOwt%化0H水溶液調(diào)節(jié)抑呈中性后過濾，對 截留物經(jīng)浸泡、洗涂、過濾和干燥；
[0027] (4)將 X-[ciVi^X 分別與

在溶劑乙臘(5V)反應(yīng)，減壓除去溶劑，得到季錠鹽；
[0028] (5)將所述步驟（3)合成的低聚殼聚糖贓嗦二酬酷胺分散于丙酬（3V)中，加入 20wt % NaOH水溶液，進行堿化，然后加入季錠鹽，進行季錠化反應(yīng)，最后出料漿；
[0029] (6)將所述步驟(5)制備的料漿調(diào)節(jié)中性后過濾，對截留物經(jīng)浸泡、洗涂和干燥后， 得到改性低聚殼聚糖。
[0030] 參考W下詳細說明更易于理解本申請的上述W及其他特征、方面和優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0031] 參選W下本發(fā)明的優(yōu)選實施方法的詳述W及包括的實施例可更容易地理解本公 開內(nèi)容。在W下說明書和權(quán)利要求書中會提及大量術(shù)語，運些術(shù)語被定義為具有W下含義。
[0032] 單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)討論對象，除非上下文中另外清楚地指明。
[0033] "任選的"或者"任選地"是指其后描述的事項或事件可W發(fā)生或不發(fā)生，而且該描 述包括事件發(fā)生的情形和事件不發(fā)生的情形。
[0034] 說明書和權(quán)利要求書中的近似用語用來修飾數(shù)量，表示本發(fā)明并不限定于該具體 數(shù)量，還包括與該數(shù)量接近的可接受的而不會導(dǎo)致相關(guān)基本功能的改變的修正的部分。相 應(yīng)的，用"大約"、"約"等修飾一個數(shù)值，意為本發(fā)明不限于該精確數(shù)值。在某些例子中，近似 用語可能對應(yīng)于測量數(shù)值的儀器的精度。在本申請說明書和權(quán)利要求書中，范圍限定可W 組合和/或互換，如果沒有另外說明運些范圍包括其間所含有的所有子范圍。
[0035] 本申請的第一方面設(shè)及用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的改性低聚殼聚糖，所述改性低聚殼聚糖分 子結(jié)構(gòu)上至少接枝贓嗦二酬酸和季錠鹽。
[0036] 本發(fā)明的改性低聚殼聚糖作為抑菌劑的應(yīng)用，所述的抑菌劑對革蘭氏陽性菌（金 黃色葡萄球菌）、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌）、弧菌、嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌等多種 細菌及白色念珠菌等真菌具有抑制作用。
[0037] 本申請使用的術(shù)語"低聚殼聚糖"是指包含殼聚糖單體單元的聚合物。在一種實施 方式中，殼聚糖單體可W由下式表示
[00；3 引
[0039] 在一種實施方式中，低聚殼聚糖可W由下式表示
[0040]
[0041 ] 其中η約為16~310,在優(yōu)選的實施方式中，η為16~124。
[0042]殼聚糖具有廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌等多種細菌均有明 顯的抑制和殺滅作用。其抗菌作用機理主要分為兩類:對于大分子殼聚糖，主要通過高分子 鏈密集于細菌的表面形成一層高分子膜，影響體外的營養(yǎng)物質(zhì)向細胞內(nèi)運輸，阻止代謝物 的排泄，使細菌菌體的新陳代謝素亂，從而達到殺菌抑菌的作用;對于小分子殼聚糖，可W 通過滲透作用到達細菌內(nèi)部，吸附細胞體內(nèi)帶有陰離子的細胞質(zhì)，并使其發(fā)生絮凝、變性， 擾亂細菌的正常生理活動，起到抗菌滅菌的作用。
[0043] 殼聚糖可促進郵類蟻殼生長，增強免疫防御能力。此外，還可W改善水質(zhì)。使用水 產(chǎn)用低分子量殼聚糖粉對養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮和亞硝酸鹽有明顯降低作用，且在改善水質(zhì) 的同時還能抑制水產(chǎn)動物病原菌生長，預(yù)防疾病，使羅氏沼郵活力旺盛、體色鮮艷、品質(zhì)佳。 殼聚糖作為羅非魚飼料添加劑能在飼料表面形成一層保護膜，從而延長飼料的水化時間W 保護養(yǎng)分;防止霉變，減少對水源的污染。低分子量殼聚糖還可W保護生物體組織細胞膜免 受自由基攻擊，間接降低金屬硫蛋白在儒脅迫下的應(yīng)激壓力，減輕水生動物受到重金屬的 危害。
[0044] 用殼聚糖降解制備的重均分子質(zhì)量在5000~10000的低分子殼聚糖對細菌和微生 物有一定抑制作用，且運種抑制作用隨著質(zhì)量濃度增加而增強.殼聚糖對不同細菌的抑制 效果隨著分子量的變化而變化，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抗菌作用隨分子量減小而逐漸 減弱，對大腸桿菌分子量越小，抗菌作用越明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖具有抑制變鏈菌生長 的功效，帶正電荷的殼聚糖分子與細菌帶負電荷的細胞膜作用，使其胞壁受損，殼聚糖易透 過受損的胞壁進入胞核內(nèi)，與分子結(jié)合破壞DNA合成，從而具有抗菌活性。
[0045] 重均分子量的測定：當(dāng)入射光電磁波通過介質(zhì)時，使介質(zhì)中的小粒子(如高分子） 中的電子產(chǎn)生強迫振動，從而產(chǎn)生二次波源向各方向發(fā)射與振蕩電場(入射光電磁波）同樣 頻率的散射光波。運種散射波的強弱和小粒子(高分子）中的偶極子數(shù)量相關(guān)，即和該高分 子的質(zhì)量或摩爾質(zhì)量有關(guān)。根據(jù)上述原理，使用激光光散射儀對高分子稀溶液測定和入射 光呈小角度(2°-7°)散射光強度，從而計算出稀溶液中高分子的絕對重均分子量(MW)值。采 用動態(tài)光散射的測定可W測定粒子(高分子)的流體力學(xué)半徑的分布，進而計算得到高分子 分子量的分布曲線。
[0046] 本申請使用的術(shù)語"改性低聚殼聚糖"是指用贓嗦二酬酸改性低聚殼聚糖，再用季 錠鹽對改性的低聚殼聚糖進行改性處理得到。
[0047] 本發(fā)明旨在把殼聚糖作為先導(dǎo)化合物，對殼聚糖分子進行修飾。為了增強殼聚糖 的殺菌抑菌活性，本發(fā)明采取如下兩種途徑：
[0048] 第一，對殼聚糖分子進行修飾，把具有殺菌抑菌活性的活性基團贓嗦二酬酸接入 殼聚糖分子，使得接入的活性基團與殼聚糖自身的活性相互增效，達到增強殺菌抑菌活性 的目的。
[0049] 第二，增強殼聚糖殺菌抑菌活性。殼聚糖的生物活性源于其C2位活潑的氨基基團， C3和C6位活潑的徑基基團，其中殺菌抑菌活性主要與氨基基團有關(guān)，氨基的聚陽離子也就是 氨基的正電性起到關(guān)鍵作用。通過對殼聚糖進行修飾，可W改變氨基的正電性強弱，增強殼 聚糖的殺菌抑菌活性，即對改性的低聚殼聚糖接枝季錠鹽進一步增強制備產(chǎn)物的溶解性并 同時增加抑菌活性中屯、，從而制備一種新型具有多抗菌活性中屯、的抑菌劑。
[0050] 本發(fā)明中贓嗦二酬酸具有殺菌抑菌活性。二酬贓嗦類化合物作為一類生物活性很 強的化合物，其結(jié)構(gòu)和活性具有穩(wěn)定性、新穎性和獨特性等優(yōu)點，因此在醫(yī)藥、食品及天然 產(chǎn)物開發(fā)研究等眾多領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，因其可作為活性先導(dǎo)化合物，在尋找蛋 白作用受點、藥物祀點等方面也扮演重要角色。近年來，人們對二酬贓嗦類化合物的結(jié)構(gòu)、 功能等都開始有了逐步的了解，且從動植物及海洋微生物，尤其是海綿共棲細菌中提取、分 離到的二酬贓嗦類化合物的數(shù)量也逐年增加，由于其結(jié)構(gòu)新穎、功能奇特等優(yōu)點引起眾多 學(xué)者的重視。
[0051] 二酬贓嗦類化合物的基本結(jié)構(gòu)是由兩個氨基酸縮合而成的環(huán)二膚，因其骨架具有 穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，且有兩個氨鍵給體和兩個氨鍵受體，使得DKPs具有較強的生物活性和 藥理活性，在藥物化學(xué)中成為一個重要的藥效團。近年來從海洋微