一種核苷磷酸化酶、編碼基因及其高產(chǎn)菌株和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種核巧憐酸化酶、編碼基因及其高產(chǎn) 菌株和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然核巧是由核糖或脫氧核糖與天然堿基所形成，由于天然堿基的多樣性，構(gòu)成 的核糖核巧或脫氧核糖核巧也是種類(lèi)繁多。天然核巧中的堿基或糖基經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾形成新 的核巧，運(yùn)種經(jīng)過(guò)人工合成的核巧即為核巧類(lèi)似物。核巧類(lèi)似物與核巧酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具 有類(lèi)似性，可W假亂真混入DNA合成的過(guò)程中，但因其不具備核巧酸的功能，所W導(dǎo)致合成 的核酸鏈?zhǔn)チ苏５墓δ?。通過(guò)氮雜、脫氮、取代等化學(xué)修飾方法，對(duì)正常堿基的喀晚和 嚷嶺進(jìn)行修飾就可得到核巧類(lèi)藥物。核巧類(lèi)似物在病毒或腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)表達(dá)的過(guò)程 中，被整合到DNA鏈中，不僅大大降低了聚合酶的活性，也終止了DNA的合成，從而使病毒細(xì) 胞無(wú)法增殖傳代，導(dǎo)致病毒的滅亡。因此，核巧類(lèi)藥物在治療艾滋病毒、乙肝病毒、腫瘤等領(lǐng) 域表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在目前使用的抗病毒藥物中有將近50%是核巧類(lèi)藥物。
[0003] 核巧類(lèi)藥物中的5-氣尿巧是一種重要的5-氣喀晚類(lèi)衍生物，可W制備多種抗癌抗 病毒藥物，特別是可W做為抗腫瘤新藥氣鐵龍（DFUR)的前體。氣鐵龍（2'-deoxy-5- f luorouridine)為脈喀晚類(lèi)抗代謝物，屬細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，可抑制胸腺喀晚脫氧 核巧酸合成酶，阻斷脈喀晚脫氧核巧酸轉(zhuǎn)變成胸腺喀晚核巧酸，從而影響DNA的合成，起到 抗病毒和抗腫瘤的作用。該藥對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，臨床上主要用于治療 肝癌、胃腸系癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等，與常用抗腫瘤藥物5-氣脈喀晚巧-fluorouracil) 相比，具有低細(xì)胞毒性和易于在體內(nèi)被吸收的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，常采用化學(xué)法糖基化得到脫氧氣尿巧，產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)多種同分異構(gòu) 體，并且合成步驟繁多，需要對(duì)堿基或核糖基上的活性基團(tuán)進(jìn)行修飾保護(hù)，且合成過(guò)程中大 量使用有機(jī)溶劑，同時(shí)還要使用毒性較大的氣化物、漠化物、重金屬等，對(duì)環(huán)境造成巨大的 污染。核巧憐酸化酶可W催化核巧或脫氧核巧的糖巧鍵的可逆憐酸化反應(yīng)，提供核糖-1-憐 酸，并釋放堿基，加入其它堿基可形成另一種新的核巧。因此，核巧憐酸化酶主要用作酶法 合成核巧類(lèi)似物的工具。但是，現(xiàn)有核巧憐酸化酶的轉(zhuǎn)化率較低，制備核巧類(lèi)藥物的成本較 局。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種核巧憐酸化酶高產(chǎn)菌株，產(chǎn)生的核巧憐酸化酶能夠高效 制備核巧類(lèi)似物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供核巧憐酸化酶及其編碼基因，該酶能夠用于高效制備核 巧類(lèi)似物。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先從本實(shí)驗(yàn)室耐有機(jī)溶劑菌庫(kù)中篩選獲得一株 核巧憐酸化酶產(chǎn)生菌，分類(lèi)命名為波茨坦短芽抱桿菌（Brevibacillus borstelensis) LKOl，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2015685。
[000引本發(fā)明對(duì)波茨坦短芽抱桿菌(Brevibacillus borstelensis)LK01的生物學(xué)特性 進(jìn)行鑒定，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體的形態(tài)特征為桿狀，細(xì)胞大小為(0.3~0.4μπι)*(2 ~7μπι)，有明顯的凹陷，周生鞭毛，中生芽抱，運(yùn)動(dòng)。菌落呈圓形，顏色為乳白色，表面光滑， 不透明，不凹起。氧化酶反應(yīng)呈陰性，明膠反應(yīng)呈陽(yáng)性。淀粉水解實(shí)驗(yàn)呈陰性，硝酸鹽反應(yīng)呈 陽(yáng)性，VP反應(yīng)呈陰性，葡萄糖反應(yīng)呈陽(yáng)性，巧樣酸反應(yīng)呈陽(yáng)性，阿拉伯糖反應(yīng)呈陰性，木糖反 應(yīng)呈陰性。
[0009] 本發(fā)明篩選的LK01菌株通過(guò)16s rDNA基因序列對(duì)比分析，與波茨坦短芽抱桿菌 (Brevibacillus borstelensis)的16s rDNA基因序列相似度最高，相似度為83.4%，結(jié)合 菌體形態(tài)特征，生長(zhǎng)條件，生理生化特性，確定為波茨坦短芽抱桿菌（Brevibacillus borstelensis)。波茨坦短芽抱桿菌（Brevibacillus borstelensis)LK01能夠產(chǎn)生核巧憐 酸化酶巧NP。
[0010] 本發(fā)明分離克隆到核巧憐酸化酶PyNP的編碼基因，它具有SEQ ID NO: 1所示的核 巧酸序列，全長(zhǎng)為1308個(gè)核巧酸，編碼435個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。為 此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供了優(yōu)良的基因材料。
[0011] 本發(fā)明構(gòu)建核巧憐酸化酶巧NP基因的表達(dá)載體。它可W通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將本 發(fā)明所述基因連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市 售的質(zhì)粒、粘粒、隧菌體或病毒載體等，優(yōu)選祀T28a。較佳的，可通過(guò)下述方法制得本發(fā)明的 重組表達(dá)載體:將通過(guò)PCR擴(kuò)增所得核巧憐酸化酶PyNP基因片段用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和 化e I進(jìn)行雙酶切，同時(shí)將載體pET28a用限制性?xún)?nèi)切酶BamH巧日Nhe I進(jìn)行雙酶切，然后采 用T4DNA連接酶連接，形成含有本發(fā)明核巧憐酸化酶巧NP基因的重組表達(dá)載體祀T-PyNP。
[0012] 本發(fā)明將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞制得重組菌。所述的宿主可為本領(lǐng)域 常規(guī)的各種宿主，只要能滿(mǎn)足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的核巧 憐酸化酶PyNP基因能被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸埃希氏菌，即 E. CO1 i化21 (DE3)。將前述重組表達(dá)載體祀T-PyNP轉(zhuǎn)化至E. CO1 i化21 (DE3)，即可得本發(fā) 明優(yōu)選的重組菌，即E. CO1 i BL21 (DE3) /pET-PyNP。
[0013] 本發(fā)明還提供一種制備重組核巧憐酸化酶的方法，其包括如下步驟:培養(yǎng)本發(fā)明 前述的重組菌，獲得重組表達(dá)的核巧憐酸化酶PyNP。其中，所述的培養(yǎng)重組菌中所用的培養(yǎng) 基可為本領(lǐng)域常規(guī)的任何可使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明核巧憐酸化酶PyNP的培養(yǎng)基。優(yōu)選 LB培養(yǎng)基，含有蛋白腺lOg/L，酵母膏5g/L，化C1 lOg/L，抑7.0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒(méi)有特 殊的限制，可W根據(jù)宿主類(lèi)型和培養(yǎng)方法等因素的不同，按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x 擇，只要是重組菌能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明所述的核巧憐酸化酶PyNP即可。其他培養(yǎng)重組菌 的具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，優(yōu)選下述方法：將本發(fā)明設(shè)及的重組菌E.coli BL21 (DE3)/pET-PyNP接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600達(dá)至IjO. 6-1.0時(shí)， 在終濃度為〇.1-1.〇111111〇1/1的異丙基-0-〇-硫代化喃半乳糖巧(1?了6)的誘導(dǎo)下，高效表達(dá)本 發(fā)明的重組核巧憐酸化酶巧NP。
[0014] 本發(fā)明還提供所述核巧憐酸化酶、重組表達(dá)載體或重組菌在合成核巧類(lèi)似物中的 應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明提供采用含有所述核巧憐酸化酶基因的重組菌或所述重組菌的培養(yǎng)物或 所述核巧憐酸化酶催化合成核巧類(lèi)似物。優(yōu)選的技術(shù)方案中，催化合成核巧類(lèi)似物反應(yīng)中， 核糖供體為尿巧、2 脫氧尿巧、胸巧、2 '，3 雙脫氧胸巧或阿糖尿巧，堿基受體為5-甲基脈 喀晚、胸腺喀晚、5-氣脈喀晚、5-氮胞喀晚或5-氣胞喀晚。所述核巧類(lèi)似物為5-甲基尿巧、5- 氣尿巧、5-氮胞巧、5-氣胞巧、胸巧、2 脫氧-5-氣尿巧、2 脫氧-5-氮胞巧、2 脫氧-5-氣 胞巧、2 脫氧-5-氣尿巧、2 脫氧-5-氣胞巧、2 脫氧-5-氣胞巧、2 脫氧-5-甲基尿巧、阿 糖-5-氣尿巧、阿糖-5-氮胞巧或阿糖-5-氣胞巧。
[0016] 優(yōu)選地，反應(yīng)體系含有10~50mM的堿基受體，20~lOOmM的核糖供體，0.5~20U/ml 核巧憐酸化酶，溶劑為20~200mM、pH4.9~9.2的憐酸緩沖液，反應(yīng)溫度為30~65°C，反應(yīng)時(shí) 間為1~化;優(yōu)選地，堿基受體與核糖供體的濃度為1:2~5;優(yōu)選的，合成5-氣尿巧時(shí)，反應(yīng) 體系含有30mM的5-氣脈喀晚，60mM的尿巧，1.抓/mL核巧憐酸化酶，溶劑為80mM、p冊(cè).0的憐 酸緩沖液，反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)時(shí)間為化。優(yōu)選地，合成2'-脫氧5-氣尿巧時(shí)，反應(yīng)體系含 有30mM的5-氣脈喀晚，60mM的2 ' -脫氧尿巧或者胸巧，1.5U/mL核巧憐酸化酶，溶劑為80mM、 P冊(cè).0的憐酸緩沖液，反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)時(shí)間為化。
[0017]優(yōu)選的技術(shù)方案中，反應(yīng)體系中還含有〇.5-2mM邸TA，作為過(guò)渡態(tài)中間體穩(wěn)定劑。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：目前采用化學(xué)法糖基化修飾制備核巧類(lèi)藥物時(shí)，轉(zhuǎn)化率 低，會(huì)得到α，β同分異構(gòu)體，并且合成步驟繁多，需要對(duì)堿基或核糖基上的活性基團(tuán)進(jìn)行修 飾保護(hù)，且合成過(guò)程中大量使用有機(jī)溶劑，同時(shí)還要使用毒性較大的氣化物、漠化物、重金 屬等，對(duì)環(huán)境造成巨大的污染。本發(fā)明提供一種新的核巧憐酸化酶及利用重組核巧憐酸化 酶在水相中修飾得到核巧類(lèi)藥物的方法。反應(yīng)W廉價(jià)易得的（2'-脫氧)尿巧為核糖供體，在 溫和條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，產(chǎn)物成分單一，無(wú)副產(chǎn)物，底物轉(zhuǎn)化率較高，產(chǎn)物易于純化，成 功克服了目前化學(xué)法糖基化修飾核巧類(lèi)藥物存在的問(wèn)題，具有很好的應(yīng)用潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為核巧憐酸化酶PyNP基因片段的PCR擴(kuò)增電泳圖，其中：泳道1為DNA Marker; 泳道2~5為核巧憐酸化酶巧NP基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0020] 圖2為核巧憐酸化酶PyNP的聚丙締酷胺凝膠電泳圖，其中泳道1為蛋白Marker,泳 道2是純化后的核巧憐酸化酶巧NP。
[0021] 圖3為pH對(duì)核巧憐酸化酶巧NP活力的影響。
[0022] 圖4為溫度對(duì)核巧憐酸化酶巧NP活力的影響。
[0023] 波茨坦短芽抱桿菌(Brevibacillus borstelensis)LK01已被保藏，分類(lèi)命名為 &rev;Lbacillus borstelensis LK01，保藏時(shí)間為2015年11月19日，保藏單位全稱(chēng)為中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中屯、，簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO:Μ 2015685，保藏單位地址：中國(guó)，武 漢，武漢大學(xué)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1
[002引本實(shí)施例說(shuō)明產(chǎn)核巧憐酸化酶的波茨坦短芽抱桿菌（Brevibacillus borstelensis)LK01的生物學(xué)性質(zhì)及鑒定。
[00%]從本實(shí)驗(yàn)室耐有機(jī)溶劑菌庫(kù)中，獲得一株核巧憐酸化酶產(chǎn)生菌株LK01。
[0027] 菌株LKOl的生物學(xué)性質(zhì):菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體的形態(tài)特征為桿狀，細(xì)胞大小 為(0.3~0.4)μπι*(2~7)μπι，有明顯的凹陷，周生鞭毛，中生芽抱，運(yùn)動(dòng)。菌落呈圓形，顏色為 乳白色，表