一種粘質(zhì)沙雷氏菌spg-1及其產(chǎn)殼聚糖酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種微生物，特別是一種粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1，本發(fā)明還設(shè)及該菌株產(chǎn) 殼聚糖酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖酶能水解脫乙酷化的殼聚糖，因此被認為是對線性殼聚糖具有專一水解性 的酶。殼聚糖酶主要存在于放線菌、真菌、細菌和動植物等生物群體中，其主要作用于0- 1.4-氨基葡萄糖巧鍵，W內(nèi)切方式降解殼聚糖得到其低聚物。殼聚糖酶最初被分為2類，但 F址amizo等提議將其分為3類，即殼聚糖酶I、殼聚糖酶Π 、殼聚糖酶m。第一類能水解Gen- Gen鍵和Glucina-Gen鍵;第二類只能水解Gen-Gen鍵;第Ξ類既能水解Gen-Glen鍵，又能 水角軍Gen-Cenac 1 e鍵。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)不同來源的殼聚糖酶的相對分子質(zhì)量由于其結(jié)構(gòu)和組成的不同而存在 差異。植物中分離得到的殼聚糖酶分子質(zhì)量為10 000~23 000 U，而從微生物中分離得到的 殼聚糖酶分子質(zhì)量大約為20 000~40 000 U。殼聚糖酶大部分為堿性蛋白，來源于各類微生 物的殼聚糖酶，其最適pH值范圍一般在4.0~8.0。酶的等電點（PI)變化范圍也比較大，大多 集中在4.0~10.1。
[0004] 利用殼聚糖酶水解殼聚糖得到由2~10個氨基葡萄糖通過β-1，4-糖巧鍵連接而成 的低聚糖，尤其W殼寡糖為典型代表。殼寡糖的主要應(yīng)用領(lǐng)域有： (1)醫(yī)藥 殼寡糖在醫(yī)藥方面存在相當(dāng)大的潛力，可使傷口免受細菌感染，同時還有很好的透氣 效果，對傷口的愈合很有幫助?？杀蝗芫附到馍商烊坏拇x物，具有無毒、易吸收等特 點，用它作為藥物緩釋劑有很大的優(yōu)越性。1997年，有學(xué)者W低分子殼聚糖進行輔助治療， 發(fā)現(xiàn)淋己細胞和白細胞總數(shù)維持穩(wěn)定，Τ細胞數(shù)量明顯增加，運種低分子殼聚糖為抗腫瘤的 研究提供了依據(jù)。目前，細胞水平的實驗證明殼寡糖對多種腫瘤細胞有殺傷效果。
[0005] (2)食品 殼寡糖在食品領(lǐng)域的應(yīng)用更是備受關(guān)注，它具有多項生理調(diào)節(jié)功能，作為腸道益生菌 的活化因子，促進巧和礦物質(zhì)的吸收，吸附體內(nèi)重金屬等?？商娲{(diào)味品中苯甲酸鋼等化學(xué) 防腐劑，成為天然綠色防腐產(chǎn)品。它還可降低對膽固醇和脂肪的吸收，降低高血壓，被廣泛 應(yīng)用于減肥瘦身、排毒養(yǎng)顏、免疫調(diào)節(jié)等功能性飲料中?？捎盟鼘λ卟诉M行涂膜保鮮， 其膜層有良好的通透性、阻水性，同時還有防腐抗菌之功效。
[0006] (3)農(nóng)業(yè) 殼寡糖作為一種新型農(nóng)藥，兼有肥效和藥效雙重功能的特點，而且無毒無害、不污染環(huán) 境等優(yōu)點，它可改變±壤中的菌群，促進有益微生物的生長，殼寡糖還可誘導(dǎo)激活植物的 免疫系統(tǒng)，提高植物對病毒的抵抗能力，對小麥花葉病、水稻稻攝病、棉花黃萎病、番茄晚疫 病等病害具有良好的防預(yù)和治療作用，可W開發(fā)為生長調(diào)節(jié)劑、生物農(nóng)藥和肥料等。
[0007] (4)日用化工 殼寡糖具有良好的保濕效果，活化機體細胞，抑制皮膚表面有害菌滋生、抗皮膚病和吸 收紫外線等功效，重要的是其來源于生物提取物，可很好的避免普通化妝品帶來的副作用， 從而可W應(yīng)用在保濕、抗皺、防曬等類型的護膚品中；殼寡糖還具有保持頭發(fā)表面成膜的通 透性，濕潤易梳理，并有去屑止癢、防塵、抗靜電的功效。
[000引 （5)生物獸藥 利用其抗菌作用，預(yù)防和治療由金黃色葡萄球菌等細菌引起的動物疾病;還可利用殼 寡糖促進傷口的愈合，被用于外傷或骨折的輔助治療;簇甲基殼寡糖對鋒離子、鐵離子和巧 離子等均有良好的絡(luò)合作用，有望制成新的天然補鋒劑、補鐵劑和補巧劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的可W產(chǎn)殼聚糖 酶的粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1菌株。
[0010] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了上述粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1菌株產(chǎn)殼聚 糖酶的方法，W克服現(xiàn)有技術(shù)存在的酶生產(chǎn)成本高的問題。
[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過W下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明的特征包括 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia ma;rcescens)SPG-l菌株本身，W及利用該菌株產(chǎn)殼聚糖酶的方 法。
[0012] 本發(fā)明所設(shè)及的菌株是粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-l(Serratia marcescens)，W下簡稱粘 質(zhì)沙雷氏菌SPG-1或者菌株SPG-1。該菌株已于2015年12月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中屯、CCTCC，保藏號為CCTCC NO :M2015784。保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072，電話 027-68754052。
[0013] 本發(fā)明還設(shè)及上述粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens) SPG-1產(chǎn)殼聚糖酶的 方法，其特點是，其步驟如下： (1) 菌種的準(zhǔn)備:將粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1菌株在滅過菌的豐富培養(yǎng)基平板上劃線，于28 °(：靜置培養(yǎng)1~2天后，挑取單菌落進行豐富培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)1天后保存于4 Γ冰箱中備用； 所述的豐富培養(yǎng)基為：牛肉膏3g，蛋白腺lOg，化C1 5g，瓊脂15~20g，水1000血，pH 7.0 ~7.2; (2) 細胞的培養(yǎng)及粗酶液的收集:挑取斜面培養(yǎng)的菌種，接種到裝有50mL液體培養(yǎng)基 的250mLS角瓶中，在25~30°C，150~250 r/min，的搖床上培養(yǎng)18~3化后得種子液，將種子液 按5%的接種量接種于含有30~50mL液體培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，26~30°C，150~200 r/min 搖床培養(yǎng)60~7化后取出，在8000 r/min離屯、去除菌體沉淀，收集上清液即為粗酶液，置于4 °C冰箱中膽存?zhèn)溆茫凰龅囊后w培養(yǎng)基為：豆巧粉25 g，薦糖20 g，K2HP化2 g，K出Κ)4 2 g，NaCl 5 g，MgS〇4·?出0 0.5 g，水1000血，pH 6.0; (3) 殼聚糖酶的提取及純化:步驟(2)中粗酶液，采用1倍體積的乙醇提取時，得比酶活 為24 U/mg protein的粗酶沉淀；用Sephadex G75分離純化所得酶的比酶活為30 U/mg protein,SDS-PAGE法測得分離純化得到的殼聚糖酶相對分子質(zhì)量為30000,用等電點聚沉 法初步測得殼聚糖酶的等電點為5.98。
[0014] W上所述的產(chǎn)殼聚糖酶的方法技術(shù)方案中，進一步優(yōu)選的技術(shù)特征是：步驟（2) 中：挑取斜面培養(yǎng)的菌種，接種到裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，25°C，200 r/ min，搖床上培養(yǎng)24h后得種子液。
[0015] W上所述的產(chǎn)殼聚糖酶的方法技術(shù)方案中，進一步優(yōu)選的技術(shù)特征是：步驟（2) 中：將種子液按5%的接種量接種于含有40mL液體培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，28°C，180 r/min 搖床培養(yǎng)72h后取出。
[0016] W下對本發(fā)明進行進一步的闡述。
[0017 ] -、本發(fā)明菌株粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1的篩選方法。
[0018]該菌株粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1是通過如下的方法篩選獲得的： 除去±樣里的雜物，取±樣少許加入裝有5mL富集培養(yǎng)基(膠體殼聚糖5,小分子殼聚 糖 3,牛肉膏 2，（NH4)2S04 10，K2HP04 2，Κ此P〇4 2，NaCl 5，MgS〇4*7此0 0.25,水 lOOOmL， pH 6. 5)的試管中，在搖床中于30 °C，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)2 d;富集后取少許培養(yǎng)液， 稀釋涂初篩培養(yǎng)基（酵母膏1，膠體殼聚糖10,粉末殼聚糖(分子量5萬）5，（NH4)2S04 5， K2HP04 2，NaC15，MgS04·7出0 0.5，瓊脂15~20，水 1000mL，pH6.5~7.5)平板，30°C倒 置培養(yǎng)3 d。再挑取單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基（蛋白腺5,酵母提取物5,葡萄糖5， K2HP04 2，K此P04 2，NaC15，MgS04·7出0 0.5，水 1000mL，pH6.5~7.5)，在28°C，180r/ min的搖床上培養(yǎng)2地后得種子液，將種子液按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(粉末殼聚糖 10,葡萄糖 1.0,酵母提取物 3，（NH4)2S04 5，K2冊〇4 2,化C1 5，MgS〇4.7H2〇 0.5,水 lOOOmL，抑6)，于28°C，180r/min搖床培養(yǎng)60h后取出，在8000 r/min離屯、去除菌體沉淀， 收集上清液即為粗酶液，用DNS法測定殼聚糖酶活力，最后從50株侯選菌株中選出一株產(chǎn)殼 聚糖酶的微生物:粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1。
[0019]二、粘質(zhì)沙雷氏菌SPG-1菌株的性質(zhì)。<