一種利用淡紫擬青霉yt08生產(chǎn)殼聚糖酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及一種利用淡紫擬青霉YT08生產(chǎn)殼聚糖酶 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖是由D-氨基葡萄糖通過β-1,4-糖巧鍵連接的一類陽離子型氨基多糖，是幾 下質(zhì)部分或完全脫乙酷基的衍生物，由于在生理?xiàng)l件下的低溶解性和高粘度導(dǎo)致其有效應(yīng) 用受到阻礙。殼寡糖是殼聚糖經(jīng)水解后產(chǎn)生的一類聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖類化 合物，具有獨(dú)特的生理活性和優(yōu)越的功能性質(zhì)，在食品、工業(yè)、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域具有重要應(yīng) 用。
[0003] 殼聚糖酶(CMtosanase，EC 3.2.1.132)是一類催化氨基葡萄糖間的護(hù)1，4-糖巧 鍵斷裂，專一性降解殼聚糖的糖巧水解酶，是在催化殼聚糖底物水解轉(zhuǎn)化制備殼寡糖的產(chǎn) 業(yè)化領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景的酶類，尤其是在低分子量且高生理活性的殼寡糖制備方面的 應(yīng)用引人注目。根據(jù)其作用位點(diǎn)不同，殼聚糖酶可分為3類：1)水解GlcN-GlcN鍵及GlcNAc- GlcN鍵；2)只能水解GlcN-GlcN鍵；3)既可水解GlcN-GlcN鍵又可水解GlcN-GlcNAc鍵。所有 殼聚糖酶有一個(gè)共同催化性質(zhì)就是要求糖巧鍵的一側(cè)至少有1個(gè)GlcN殘基，而不能催化 GlcNAc-GlcNAc鍵的斷裂，不同生物來源殼聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成產(chǎn)物殼寡 糖聚合度存在差異。
[0004] 殼聚糖酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌、放線菌、藍(lán)藻和植物等生物體中，其中細(xì)菌來源 的殼聚糖酶的研究報(bào)道較多，而真菌來源的相對(duì)較少。從已有發(fā)表文獻(xiàn)的結(jié)果，雖然殼聚糖 酶的生物來源較多，但是多數(shù)生物體的殼聚糖酶產(chǎn)量偏少，難W進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。本發(fā) 明是在篩選獲得一株用于番茄和葡萄根結(jié)線蟲害防治的淡紫擬青霉（發(fā)明專利CN 104818216 A)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)該菌株也高產(chǎn)殼聚糖酶，W此確定其培養(yǎng)方法，并適應(yīng)于產(chǎn)業(yè) 化生產(chǎn)制備殼聚糖酶，進(jìn)一步應(yīng)用于殼寡糖轉(zhuǎn)化制造領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)存在的不足，提供一種利用淡紫擬青霉YT08菌株發(fā)酵生產(chǎn)高 活性殼聚糖酶的方法，所述的酶可通過高效水解殼聚糖來生產(chǎn)高生理活性的殼寡糖。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 淡紫擬青霉(paecilomyces lelacinus)YT08菌株，保藏單位：中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期： 2014年 11 月26日，保藏號(hào)為CGMCC No. 10026。
[000引本發(fā)明提供一種利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的方法，具體步驟如下：
[0009] (1)菌種活化：取保存的淡紫擬青霉YT08菌種接種于活化培養(yǎng)基中，在28°C、 20化pm下培養(yǎng)至菌體渾濁，制得活化種子液；
[0010] 進(jìn)一步，所述的活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白腺5,葡萄糖10,憐酸二氨鐘1，硫酸儀0.5， pH 7.0，12rC滅菌20min備用。
[0011] (2)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶:按照0.2~0.8%(v/v)的接種量在滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中 接入步驟（1)活化種子液，在18化pm的旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)，控制溫度為30~34°C，發(fā)酵3-5d后 培養(yǎng)完畢，發(fā)酵液經(jīng)離屯、過濾除菌后直接作為殼聚糖酶液使用；或者在發(fā)酵罐中W70%的 體積比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)118°C蒸汽滅菌20min后，按照0.2~0.8%(v/v)的比例接入活 化的菌種，控制發(fā)酵過程中的抑始終維持在抑5~6.5，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在30~34°C，溶解氧 維持在10% (mg/ml)W上，經(jīng)發(fā)酵2-4d后發(fā)酵完畢，經(jīng)離屯、過濾除菌后直接作為殼聚糖酶液 使用。
[0012] 進(jìn)一步，所述得發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):甘油10~20,大豆蛋白腺20~35，MnS化0.5~ 2.5，粉末殼聚糖(85%^上的脫乙酷度）12~20，船(：12.5~4，(：曰(：12〇.5~1.5，]\%5〇4 1.5 ~3.5，F(xiàn)eS〇4 0.5~2,地 5~6.5。
[0013] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果在于：
[0014] (1)產(chǎn)殼聚糖酶的活力高
[0015] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法，酶活力高于W往多數(shù)報(bào)道的酶活力值，表明其單位時(shí)空產(chǎn)率 增加幅度大，具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)潛力。
[0016] (2)培養(yǎng)方法簡單
[0017] 淡紫擬青霉YT08的培養(yǎng)方法簡單，對(duì)于碳源等營養(yǎng)因子需求低，培養(yǎng)容易且過程 不易染菌;發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中不需要復(fù)雜的補(bǔ)料工藝，適合工廠化放大生產(chǎn)。
[0018] (3)培養(yǎng)方法切合實(shí)際，酶活提高幅度大
[0019] 采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，在實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)過程中的殼聚糖酶活力值，與初期的培 養(yǎng)方法比較，其酶產(chǎn)量提高了 100多倍，培養(yǎng)方法的產(chǎn)量突出。
[0020] (4)殼聚糖酶的生物來源新型
[0021] 本發(fā)明設(shè)及的是淡紫擬青霉來源殼聚糖酶的培養(yǎng)方法，目前還未見該生物來源殼 聚糖酶的產(chǎn)業(yè)化報(bào)道，市場前景應(yīng)用廣闊。
【附圖說明】
[0022] 圖1為實(shí)施例3中淡紫擬青霉YT08搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023] W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，運(yùn)些實(shí)施例用于理解而不是限 制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 實(shí)施例1:淡紫擬青霉YT08生產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵組分優(yōu)化
[0025] 碳源對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響見表1，可W看出甘油、薦糖和甘露醇作為碳源發(fā)酵 生產(chǎn)殼聚糖酶的效果較好，最好的是甘油。所用的初始培養(yǎng)基成分(g/L):酵母粉3,蛋白腺 5，硝酸錠2，硫酸儀1，硫酸錠0.5，憐酸氨二鐘3，憐酸二氨鋼1，粉末殼聚糖5，碳源30，其中碳 源為葡萄糖、麥芽糖、果糖、薦糖、甘油、糊精、淀粉、甘露醇，接入活化種子后在18化pm和30 °C的搖床中發(fā)酵48h后測定酶活力。
[0026] 表1碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0027]
[0028] ~氮源對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響見表2,大豆蛋白腺、酵母膏、膜蛋白腺、酵母粉是發(fā) 酵生產(chǎn)殼聚糖酶的較好氮源，其中最佳氮源為大豆蛋白腺。所用的初始培養(yǎng)基組分(g/L): 甘油30,氮源10,硫酸儀1，憐酸氨二鐘3,憐酸二氨鋼1，粉末殼聚糖5,接入活化種子后在 18化pm和30°C的搖床中發(fā)酵4她后測定酶活力。
[0029] 表2氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0030]
[0031]
[0032] 金屬鹽對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響見表3,對(duì)殼聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)具有正效應(yīng)的因 素是硫酸儘、氯化鋼、硫酸儀、氯化巧和硫酸亞鐵，其中最佳產(chǎn)酶的金屬鹽為硫酸儘。所用的 初始培養(yǎng)基組分(g/L):甘油30,大豆蛋白腺10,金屬鹽2,粉末殼聚糖5,接入活化種子后在 18化pm和30°C的搖床中發(fā)酵4她后測定酶活力。
[0033] 表3金屬鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0034]
[0035] 誘導(dǎo)物對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響見表4,可W看出添加粉末殼聚糖對(duì)殼聚糖酶的 誘導(dǎo)效果最好，所用的初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油30,大豆蛋白腺10,硫酸儘1，硫酸儀1，氯 化鋼1，誘導(dǎo)物5。
[0036] 表4誘導(dǎo)物對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0037]
[0038] 選取對(duì)淡紫擬青霉YT08發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶有正影響的因素：甘油(XI)、大豆蛋白 腺（X2)、NaCl(X3)、FeS〇4(X4)、CaCl2(Xs)、MgS〇4(X6)、MnS〇4(X7)、粉末殼聚糖（X8)，進(jìn)行 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)W篩選對(duì)菌株產(chǎn)酶有顯著影響的培養(yǎng)因子，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)和測定 結(jié)果見表5。利用Desi即 E邱ert 7.1.6(Sl:at-Ease , Inc. ,Minneapolis ,USA)軟件分析，表 明甘油(Xi)、大豆蛋白腺(X2)、MnS〇4(X7)、粉末殼聚糖(X8)是對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶影響極其顯 著的培養(yǎng)因子。
[0039] 表SPlackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與顯著因素篩選
[0040]
[0041 ] 采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):化Cl 3，F(xiàn)eS〇4 l，CaCb l，MgS〇4 2,對(duì)甘油(Xi)、大豆 蛋白腺(X2)、MnS化(X?)、粉末殼聚糖(X8)運(yùn)四個(gè)因素進(jìn)行爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化，其結(jié)果見表 6，可W看出序號(hào)4組獲得最大殼聚糖酶活力。
[0042] 表6爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化
[0043]
[0044] W爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化的結(jié)果為中屯、點(diǎn)，進(jìn)行甘油（XI)、大豆蛋白腺(X2)、MnS〇4 (&)、粉末殼聚糖(X8)運(yùn)四個(gè)培養(yǎng)組分的中屯、組合設(shè)計(jì)與優(yōu)化，其組合設(shè)計(jì)和結(jié)果見表7。利 用Desi即 Expert 7.1.6(Stat-Ease, Inc. ,Minneapolis ,USA)軟件分析，表明將甘油的濃 度調(diào)至12g/L，大豆蛋白腺的濃度調(diào)至29g/L，硫酸儘的濃度調(diào)至Ig/L，粉末殼聚糖的濃度調(diào) 至18g/L，可W得到最大的殼聚糖酶活性，為14.50U/mL。采用中屯、組合設(shè)計(jì)優(yōu)化獲得的培養(yǎng) 組分，發(fā)酵4她后殼聚糖酶活性值為14.5抓/mL，故本優(yōu)化設(shè)計(jì)方案準(zhǔn)確。
[0045] 表7中屯、組合設(shè)計(jì)培養(yǎng)組分與優(yōu)化
[0046]
[0047] 實(shí)施例2:淡紫擬青霉YT08生產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化
[004引采用實(shí)施例1中的優(yōu)化培養(yǎng)組分(g/L):甘油12,大豆蛋白腺29,化C1 3，F(xiàn)eS化1， 化C12 l，MgS化2，MnS04 1，粉末殼聚糖18,通過對(duì)不同培養(yǎng)抑、培養(yǎng)溫度和接種量條件下的 發(fā)酵96h后的培養(yǎng)物進(jìn)行殼聚糖酶活力測定，其結(jié)果見表8、表9和表10,可W看出淡紫擬青 霉YT08產(chǎn)殼聚糖酶的最優(yōu)培養(yǎng)pH為6，溫度為32°C，接種量為0.6% (v/v)。
[0049]表8培養(yǎng)抑對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[(K)加 ]

[0055] W單因素優(yōu)化的培養(yǎng)溫度、抑和接種量為中屯、點(diǎn)，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，深入優(yōu) 化優(yōu)化培養(yǎng)條件，其組合設(shè)計(jì)和優(yōu)化結(jié)果見表11。利用Design Expert 7.1.6(Stat-Ease, 1〇(3.，1111116曰9〇113