一種三維細胞模型的構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)模型的構建方法，尤其是一種三維細胞培養(yǎng)模型的構建方法。
【背景技術】
[0002]目前，腫瘤相關的基礎研究大多建立在二維細胞培養(yǎng)基礎上，其特點是簡便易操作，易于研究單細胞的表型變化。但是此類研究卻難以從腫瘤組織的立體結構特點上模擬體內細胞的組織微環(huán)境，故而無法準確反映腫瘤細胞在三維空間組織中的表型特點。
[0003]三維細胞培養(yǎng)作為有別于傳統(tǒng)二維平板細胞培養(yǎng)的嶄新的細胞培養(yǎng)模式，能在體外最大限度地反映體內細胞微環(huán)境的結構基礎:I)可較真實地反映腫瘤在體內的發(fā)生過程:細胞通過其表面的特異性受體特別是整合素家族受體實現(xiàn)細胞與細胞之間以及細胞與基質之間的病理聯(lián)系及信號傳導；2)可再現(xiàn)腫瘤組織中細胞內及細胞間的信號通路蛋白及關鍵生命分子表達的動態(tài)演變過程。因而，三維細胞培養(yǎng)應用于腫瘤表型研究具有獨特的優(yōu)勢。
[0004]三維細胞培養(yǎng)技術在國際上正處于發(fā)展完善階段，并在研究腫瘤細胞轉化、轉移及放化療敏感性的分子機制方面顯示出光明的應用前景。常規(guī)的三維細胞培養(yǎng)過程為:I)將基質膠培養(yǎng)基(Matrigel)從-20°C中取出后置于冰上，半小時后基質膠將由固態(tài)轉變?yōu)橐簯B(tài);2).在特定的三維細胞培養(yǎng)小室中將基質膠鋪就呈穹窿型；3).室溫放置半小時至一小時基質膠將由液態(tài)恢復固態(tài)，加入細胞培養(yǎng)基并接種腫瘤細胞后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一至兩周后檢測。申請人基于此模型的放療敏感性研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞CNE-2在基質膠培養(yǎng)基中形成巨大畸形球狀實體，當予以小分子抑制劑VX-680及X線放射處理后，激光共聚焦熒光染色顯示CNE-2細胞團內P53及P21表達上調并誘導CNE-2三維細胞團發(fā)生凋亡(Cleaved Caspase_3表達明顯升高)，隨后細胞團松散一猶如體內反射線處理后腫瘤組織的消退過程(結果已發(fā)表于國際腫瘤學期刊Cancer B1logy&Therapy，2009，8( 15): 1500-1506.)
[0005]目前，三維細胞模型構建過程中主要存在以下問題:(I)三維細胞模型難以構建:首先需要構建猶如穹窿狀的基質膠團塊，基質膠反復凍融后難以形成穹窿狀，即便是首次使用的嶄新的基質膠，其穹窿狀塑形亦需非常嫻熟的技巧，而一旦穹窿狀塑形不佳，如出現(xiàn)偏心或塌陷，將直接導致后續(xù)檢測過程難度的加大，甚至無法檢測;如出現(xiàn)三維基質膠培養(yǎng)模型與培養(yǎng)小室四壁接觸，則會直接導致模型構建失敗而無法進行后續(xù)試驗。(2)構建后培養(yǎng)成型時間長:常規(guī)情況下腫瘤細胞在基質膠上需要約7-14天方能形成球型空間結構。(3)檢測難度大:常規(guī)基質膠在培養(yǎng)基中浸泡一周后易出現(xiàn)膨脹軟化，因而在后續(xù)三維免疫熒光染色時非常易于出現(xiàn)三維基質膠碎裂，進而無法完成后續(xù)染色及三維重建。
[0006]導致現(xiàn)有三維細胞模型構成過程中的問題的原因主要有以下幾個方面:(a)常規(guī)手工方法塑形的不均一性:傳統(tǒng)三維模型構建與操作者的熟練程度密切相關，但是由于人為因素常造成三維培養(yǎng)模型的不均一性，具體表現(xiàn)為:外形不均一(偏心、塌陷)及三維模型內部不均一(主要由于塑形凝固過程中基質膠的流動造成)。卬)塑形失敗:常規(guī)手工方法塑形時易發(fā)生基質膠與培養(yǎng)小室四壁接觸的情況，而一旦發(fā)生接觸，由于液體張力原因，基質膠迅速流向培養(yǎng)小室四壁，形成四周高中間低的“碗狀”構型，導致塑形失敗。此種情況在手工塑形過程中極易發(fā)生，成為塑形失敗的重要原因之一。(C)檢測困難:基于基質膠的三維細胞培養(yǎng)模型需要浸泡在培養(yǎng)基中生長7-14天，基質膠經過一周的浸泡后極易出現(xiàn)膨脹軟化及碎裂，在后續(xù)三維免疫染色時非常容易出現(xiàn)模型破裂變形等問題，影響檢測。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的內容在于克服上述現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種容易實現(xiàn)、所需時間較短，且構建成的三維細胞模型結構緊密、不易散開、穩(wěn)定性優(yōu)良的三維細胞模型構建方法。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為:一種三維細胞模型的構建方法，包括以下步驟:
[0009](I)將細胞種植于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后將鐵磁性納米顆粒加入到培養(yǎng)基中并混勻，培養(yǎng)至細胞密度達到80?90%，得到含有鐵磁性納米顆粒的細胞；
[0010](2)將步驟(I)所得含有鐵磁性納米顆粒的細胞重新種植于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿的上方放置與所述培養(yǎng)皿嵌合的磁力控制裝置，然后培養(yǎng)18?36小時，即得三維細胞模型；
[0011 ]所述步驟(2)中的磁力控制裝置與所述培養(yǎng)皿嵌合設置，且所述磁力控制裝置設有磁性體。
[0012]本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法，所述步驟(I)中將細胞種植于培養(yǎng)皿中以后，在培養(yǎng)基中加入鐵磁性納米顆粒，然后再進行培養(yǎng)至細胞密度達到80?90 % (一般培養(yǎng)18?36小時，具體時間依不同細胞類型而異)，此時培養(yǎng)后所得細胞中，大部分的細胞內均內吞有一定數(shù)量的鐵磁性納米顆粒。然后將含有鐵磁性納米顆粒的細胞重新種植于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿的上方放置與所述培養(yǎng)皿嵌合的磁力控制裝置，由于所述磁性控制裝置設有磁性體，而細胞內吞噬了鐵磁性納米顆粒，因此細胞可以被磁力控制裝置的磁性體吸附而懸浮與培養(yǎng)基中，并由于細胞具有自我組裝能力，大約經過18?36小時的培養(yǎng)即可形成三維細胞團，即三維細胞培養(yǎng)模型。
[0013]本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法，依靠外來的磁力將吞噬了鐵磁性納米顆粒的細胞聚集起來，懸浮培養(yǎng)，此方法不依賴于傳統(tǒng)基質膠三維培養(yǎng)細胞的方法，非常易于操作，無傳統(tǒng)基質膠三維培養(yǎng)細胞的所有限速因素，重要的是所需的構建時間大為縮短(常規(guī)的基質膠三維細胞模型構建時間約為7?14天，而本發(fā)明方法三維細胞培養(yǎng)模型的構建時間為約2?4天)，同時所構建的模型穩(wěn)定，排除了基質膠培養(yǎng)三維細胞模型時易發(fā)生軟化碎裂的問題，本發(fā)明所述方法不受試驗人員技術熟練程度等因素的影響。
[0014]本發(fā)明所述方法構建的三維細胞模型，可用于后續(xù)檢測、測試等，當需要進行檢測時，可將磁力控制裝置置于培養(yǎng)板下方，此時由于磁力的因素，三維細胞團可被吸附于培養(yǎng)皿表面，方便后續(xù)檢測等。
[0015]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(2)中的培養(yǎng)皿為6孔培養(yǎng)板、12孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板或384孔培養(yǎng)板;所述磁力控制裝置包括本體和設于所述本體上的磁性體，所述磁性體在所述本體上的分布位置及所述磁性體的數(shù)量與所述培養(yǎng)皿上的孔相對應。本發(fā)明所述步驟(2)中的培養(yǎng)皿為培養(yǎng)板，所述培養(yǎng)板可為6孔培養(yǎng)板、12孔培養(yǎng)板24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板、384孔培養(yǎng)板等。所述磁力控制裝置包括本體和設于所述本體上的磁性體，所述磁性體在所述本體上的分布位置及所述磁性體的數(shù)量與所述培養(yǎng)皿上的孔相對應，即當所述培養(yǎng)皿采用6孔培養(yǎng)板時，所述磁力控制裝置的本體上在于所述6孔培養(yǎng)板的6個孔相對應的位置設有6個磁性體，當所述磁力控制與所述6孔培養(yǎng)板嵌合時，所述磁力控制裝置本體上的6個磁性體剛好與所述6孔培養(yǎng)板的6個孔一一對應。所述培養(yǎng)皿采用12孔培養(yǎng)板24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板、384孔培養(yǎng)板時同理。
[0016]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(I)中加入的鐵磁性納米顆粒的量為:每10000細胞中加入0.5?5微升的鐵磁性納米顆粒。作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的更優(yōu)選實施方式，所述步驟(I)中加入的鐵磁性納米顆粒的量為:每10000細胞中加入I微升的鐵磁性納米顆粒。
[0017]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述鐵磁性納米顆粒采用以下方法制備而成:
[0018](a)取一容器，加入FeCl2和FeCl3得溶液A，所述溶液A中Fe2+/Fe3+的摩爾比為0.75;
[0019](b)在攪拌狀態(tài)下將氨水加入步驟(a)所得溶液A中；
[0020](c)將含有氨水的溶液A在80°C下加熱，至出現(xiàn)沉淀物質，得到Fe3O4;
[0021](d)向步驟(C)所得沉淀物質中加入含有表面活性劑的乙醇，然后再在80°C下繼續(xù)加熱15?30min，至反應完全;所述表面活性劑為油酰肌氨酸和月桂酰肌氨酸;所述表面活性劑為油酰肌氨酸和月桂酰肌氨酸，所述油酰肌氨酸和月桂酰肌氨酸的加入能夠更好保持月父體穩(wěn)定性，提尚氧化電阻率；
[0022](e)用磁鐵吸住分離，然后用蒸餾水對沉淀洗滌多次，除去可溶性雜質；
[0023](f)在60?80 °C的真空環(huán)境下對洗滌后的沉淀進行過度水分，即得鐵磁性納米顆粒。
[0024]鐵磁性納米可以是一種新型的功能材料，它是由直徑為納米量級(10納米以下)的磁性鐵顆粒表面修飾多聚賴氨酸制備而成的。在制備的眾多方法中，化學共沉淀法更簡便，成本更低，上述所述鐵磁性納米顆粒的制備方法即為化學共沉淀法。化學共沉淀法是指包含兩種或兩種以上金屬離子的可溶性鹽溶液中，加入適當沉淀劑，將金屬離子均勻沉淀或結晶出來，再將沉淀物脫水或熱分解而制得納米微粉。其特點是產品純度高，反應溫度低，顆粒均勻，粒徑小，分散性也好。但此法對于多組分來說，要求各組分具有相同或相近的水解或沉淀條件，因而工藝具有一定的局限性。
[0025]本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法中，所用的鐵磁性納米顆粒可以直接購買于市場，亦可采用上述方法制備所得。
[0026]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(b)中加入的氨水與所述溶液A的體積比為2:3?2:6，所述氨水的質量百分濃度為20?35%。作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的更優(yōu)選實施方式，所述步驟(b)中加入的氨水與所述溶液A的體積比為2:5，所述氨水的質量百分濃度為30%。
[0027]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(d)中表面活性劑與Fe3O4的摩爾比為1:3?7;所述表面活性劑中，所述月桂酸肌氨酸的摩爾含量為O?30%。作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的更優(yōu)選實施方式，所述步驟(d)中表面活性劑與Fe3O4的摩爾比為1:5。
[0028]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述鐵磁性納米顆粒的制備方法中還包括以下步驟:
[0029 ] (g)檢測步驟(f)得到的鐵磁性納米顆粒的Ze ta電位，如為負電荷，將所述鐵磁性納米顆粒中加入多聚賴氨酸，得到多聚賴氨酸修飾的Fe3O4鐵磁性納米顆粒。
[0030]作為本發(fā)明所述三維細胞模型的構建方法的優(yōu)選實施方式，所述鐵磁性納米顆粒的平均粒徑為9nm。上述所述鐵磁性納米顆粒的制備中，制備得到的鐵磁性納米顆粒的平均粒徑為9nm，且能夠在-12°C下保存