NA測(cè) 序，確定該被克隆的肌酸激酶的核巧酸序列，具體示于序列表中SEQ ID NO: 1，相應(yīng)的氨基 酸序列為序列表中的SEQ ID NO:2。
[0046] 實(shí)施例2
[0047]肌酸激酶突變體的制備
[0048] W質(zhì)粒P R S E T - C k m (見(jiàn)實(shí)施例1 )為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)3 3 A F : 5 ' ATAACACAAACTCTTAAAGATTATGATTTAACCTA 3 ' 3 3 A R ： 5 ' TCTTTAAGAGTTTGTGTTATCATTAAGATTCTCTCA 3'〇
[0049] 用引物對(duì)ckm-F和33AR擴(kuò)增F-AR片段，用引物對(duì)33AF和ckm-R擴(kuò)增AF-R片段。擴(kuò)增 反應(yīng)條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4,0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶（Promega， USA)，20ng pRSET-ckm，W及400nM引物ckm-F和400nM引物33AR(或者，400nM引物33AF和 400nM引物ckm-R)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50微升。
[00加]PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C3分鐘，35圈循環(huán):95°C50秒、52Γ30秒和72Γ3分鐘，最 后72°C5分鐘。經(jīng)1%瓊脂糖膠電泳分離并用商業(yè)試劑盒回收，分別得到F-AR片段和AF-R片 段。
[0051] 然后擴(kuò)增全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCiaOmM (NH4)2S〇4,2mM MgS〇4,0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP， 400nM引物ckm-F和400nM ckm-R，l.抓 Pfu DNA聚合酶，20ng F-AR片段與20ng AF-R片段， 用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50微升。
[0052] PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C3分鐘，35圈循環(huán):95°C50秒、52Γ30秒和72Γ3分鐘，最 后72°C5分鐘。經(jīng)1%瓊脂糖膠電泳分離并用商業(yè)試劑盒回收，得到全長(zhǎng)突變基因 V33A。 [0053] 將V3 3 A片段回收并經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nd e I和BamH I酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶 Nde巧郵amHI酶切的載體pRSET-A連接，得質(zhì)粒PRSET-V33A。將質(zhì)粒PRSET-V33A轉(zhuǎn)入感受態(tài) 細(xì)菌細(xì)胞E.coli BL21，經(jīng)DNA測(cè)序確定V33A的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所示。 [0054] 實(shí)施例3
[0055] 酶的提取與純化
[0056] 將含肌酸激酶親本基因的質(zhì)粒pRSET-ckmW及含肌酸激酶突變體基因的質(zhì)粒 PRSET-V33A分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞E.coli BL21，在Luria broth化B)平板(含50mg/L卡 那霉素)上37°C培養(yǎng)24小時(shí)。接種單個(gè)克隆于5毫升LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素）中于 3(rC培養(yǎng)20-24小時(shí)。離屯、收集菌體，并懸浮于l毫升100mM化is-HCl緩沖液(pH7.5)中。然 后用超聲波裂解細(xì)菌細(xì)胞。離屯、（1〇^，17,800肖，10分鐘)并收集上清液，即分別得肌酸激酶 親本W(wǎng)及肌酸激酶突變體的粗提蛋白（或稱粗提物）。
[0化7] 實(shí)施例4 [005引酶活性的測(cè)定
[0059]配制底物溶液：含 lOOmM 的肌酸（Creatine)、5mM 的 ATP、20mM 的 MgCl2、40mMS 聚憐 酸鋼和lOOmM化is-HCl緩沖液，調(diào)抑至7.5。取底物溶液400微升，然后分別加入100微升的 肌酸激酶親本W(wǎng)及100微升的肌酸激酶突變體于37°C進(jìn)行10分鐘反應(yīng)。離屯、（1(TC，17， 800g，15分鐘）并收集上清液，通過(guò)高壓液相色譜化化C)測(cè)定所得上清液中憐酸肌酸的含 量。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉(zhuǎn)化一微摩爾肌酸為憐酸肌酸所需之酶 量。測(cè)定結(jié)果為:肌酸激酶親本的特異性活力為3.抓/mg，肌酸激酶突變體的特異性活力為 6.3U/mg。用SDS聚丙締酷胺凝膠電泳測(cè)定酶蛋白濃度，測(cè)定結(jié)果為:肌酸激酶親本的酶比活 性為100，肌酸激酶突變體的酶比活性為180。
[0060] 實(shí)施例5
[0061 ]固定化肌酸激酶突變體的制備
[0062] 取肌酸激酶突變體粗酶，用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/O.OOlM抓TA，pH7.0溶 液)稀釋至蛋白含量為5-lOmg/ml。將酶稀釋液與PB溶液(2.0mol/L憐酸二氨鐘，PH7.5)等體 積混合，加入酶固定化載體LX-3000(10毫克酶/克載體），于搖床(轉(zhuǎn)速10化pm)中25°C反應(yīng) 20小時(shí)。反應(yīng)完成后用濾袋過(guò)濾，用洗酶緩沖液清洗5-6次，得到固定化肌酸激酶突變體。
[0063] 實(shí)施例6
[0064] 用固定化肌酸激酶突變體制備憐酸肌酸
[00化]配制底物溶液：含lOOmM的肌酸（Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mMS聚憐 酸鋼和lOOmM化is-HCl緩沖液，調(diào)pH至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化肌酸 激酶突變體。于37°C進(jìn)行反應(yīng)2-20小時(shí)。離屯、（101：，17,800肖，15分鐘）并收集上清液。通過(guò) 高壓液相色譜化PLC)測(cè)定所得上清液中憐酸肌酸的含量。結(jié)果表明：肌酸轉(zhuǎn)化為憐酸肌酸 的轉(zhuǎn)化率超過(guò)85 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過(guò)生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷為底物， 在肌酸激酶突變體的催化作用下生產(chǎn)磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID NO:3 所示的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述肌酸與所述 三磷酸腺苷的摩爾比為20:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述催化過(guò)程還 需加入MgCl2和三聚磷酸鈉。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述催化過(guò)程是 在pH值為7~8的緩沖溶液中進(jìn)行。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述緩沖溶液為 Tris-HCl緩沖溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述肌酸激酶突 變體為固定在酶固定化載體上的固定化肌酸激酶突變體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于:所述酶固定化載 體為環(huán)氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸 激酶突變體的加入量為〇. 01-0.5g/ml緩沖溶液。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸 激酶突變體的制備方法包括以下步驟： (1) 制備洗酶緩沖液:〇.02M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值為7.0; (2) 制備PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氫鉀，pH值為7 · 5; (3) 用步驟（1)制備的洗酶緩沖液將所述肌酸激酶突變體稀釋至5-10mg/ml，并將得到 的酶稀釋液與步驟(2)制備的PB溶液等體積混合，再加入所述酶固定化載體，于搖床中反 應(yīng)，所述酶固定化載體的加入量為10毫克酶/克載體； (4) 待步驟(3)反應(yīng)完全后將所得反應(yīng)液過(guò)濾，并用步驟（1)制備的洗酶緩沖液清洗，即 得固定化肌酸激酶突變體。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9任意一項(xiàng)所述的生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于，所 述肌酸激酶突變體的制備方法包括以下步驟： (1) PCR擴(kuò)增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶親本，擴(kuò)增引物對(duì)如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (2) 步驟(1)擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與載體連接，得質(zhì)粒A; (3) 以步驟(2)得到的質(zhì)粒A為模板，PCR擴(kuò)增得F-AR片段，擴(kuò)增引物對(duì)如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， 33AR:5 ' TCTTTAAGAGTTTGTGTTATCATTAAGATTCTCTCA 3 '； (4) 以步驟(2)得到的質(zhì)粒A為模板，PCR擴(kuò)增得AF-R片段，擴(kuò)增引物對(duì)如下 33AF:5 ' ATAACACAAACTCTTAAAGATTATGATTTAACCTA 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (5) 以步驟(3)得到的F-AR片段以及步驟(4)得到的AF-R片段為模板，PCR擴(kuò)增得全長(zhǎng)突 變體基因 V33A，擴(kuò)增引物對(duì)如下 ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '， ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '； (6) 步驟(5)得到的V33A經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與載體連接，得質(zhì)粒B; (7) 將步驟(6)得到的質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)并誘導(dǎo) 表達(dá)，然后進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，提取即得肌酸激酶突變體。
【專利摘要】一種通過(guò)生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，涉及磷酸肌酸的制備方法的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的方法主要解決磷酸肌酸現(xiàn)有的生物催化生產(chǎn)方法產(chǎn)率低、成本高的技術(shù)問(wèn)題，該方法具體為以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化作用下生產(chǎn)磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸序列，該氨基酸序列的特點(diǎn)是將肌酸激酶親本的氨基酸序列中第33位點(diǎn)的Val突變?yōu)锳la。該肌酸激酶突變體的比活性較肌酸激酶親本高出80%，該方法使肌酸轉(zhuǎn)化為磷酸肌酸的轉(zhuǎn)化率超過(guò)85%，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C12P13/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105671096
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610128871
【發(fā)明人】傅榮昭, 張琦
【申請(qǐng)人】邦泰生物工程(深圳)有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月8日