miR-520c核苷酸的用途、藥物組合物和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及內(nèi)源性非編碼小RNAs的新藥用途技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種miR-520c核巧 酸的用途、藥物組合物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病，發(fā)病率有逐年增高且呈年輕化的趨勢大量 臨床研究顯示，腫瘤的轉(zhuǎn)移是造成臨床死亡的最主要原因。侵襲轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞從原發(fā)性部 位轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端部位形成腫瘤的過程，它是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā) 和影響預(yù)后的重要因素，腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素調(diào)控、多步驟、多階段、連續(xù)復(fù) 雜的生物學(xué)過程。對腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞生物學(xué)與分子調(diào)控機(jī)制不斷地深入研究，如何檢測癌 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移W實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期檢測與評估，已成為抗癌轉(zhuǎn)移研究的重要共識。
[0003] MicroRNA (miRNA)是真核生物中一類長度約為22個(gè)核巧酸的參與基因轉(zhuǎn)錄后水 平調(diào)控的非編碼小分子單鏈RNA，能通過與祀mRNA特異的堿基配對引起祀mRNA的降解或 翻譯抑制，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。目前普遍認(rèn)為miRNA參與的基因調(diào)控是遺 傳程序中最基本的一步，調(diào)控細(xì)胞分化、生長、調(diào)亡、代謝等功能。由于腫瘤本質(zhì)上是一種多 基因異常疾病，通過激活一種或多種原癌基因的表達(dá)及抑癌基因的突變?nèi)笔亩鼓[瘤細(xì) 胞逃避了正常生長調(diào)控機(jī)制，自主進(jìn)行增殖和侵襲、出現(xiàn)惡性表型。研究表明多種miRNAs參 與了腫瘤細(xì)胞重要的生物程序調(diào)控，直接或間接的起著促癌基因或抑癌基因的功能。在腫 瘤的發(fā)生與發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用。因此，將miRNA作為腫瘤疾病治療的祀點(diǎn)，開發(fā)相 關(guān)藥物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。單一的miRNA可W同時(shí)作用多個(gè)祀基因 mRNA水平的表達(dá)， 影響多個(gè)信號通路，從整體上達(dá)到治療疾病的目的。由于miRNA在腫瘤不同發(fā)展階段的表達(dá) 水平不同，因此，可W通過檢查miRNA的表達(dá)水平來預(yù)測診斷疾病。
[0004] 目前研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過調(diào)控細(xì)胞增殖與細(xì)胞遷移相關(guān)祀蛋白的表達(dá)，影響 腫瘤細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移，運(yùn)些miRNA有促進(jìn)增殖的，也有抑制增殖的。尋找在腫瘤中特 異性表達(dá)。參與腫瘤細(xì)胞遷移的miRNA,闡明其作用機(jī)制，對于開發(fā)隊(duì)niRNA為策略的腫瘤疾 病的診斷、治療具有極其重要的意義的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有的不足，本發(fā)明提供了一種miR-520c核巧酸的用途、藥物組合物和 試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種單鏈非編碼miR-520c核巧酸的 用途，miR-520c核巧酸在用于診斷或預(yù)后實(shí)體瘤藥物或試劑盒中的用途，所述miR-520c核 巧酸序列為沈Q ID N0:1 所示的miR-520c-3p的序列：5'- AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU-3'；W 及沈9 10備：2所示11111?-520。-5口的序列：5'-抓(1^64666446〔4抓1]1]抓(：-3'。
[0007] 根據(jù)上述方案，進(jìn)一步包括:所述實(shí)體瘤選自鱗狀細(xì)胞癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，乳 頭狀腺癌，惡性多形性腺瘤中的一種或多種。
[000引一種用于診斷或預(yù)后實(shí)體瘤藥物組合物，藥物組合物由如下組成:miR-520c，藥學(xué) 上可接受的載體、病毒或輔料。
[0009] 根據(jù)上述方案，進(jìn)一步包括:所述miR-520c核巧酸序列為SEQ ID N0:1所示的miR- 520。-化的序列：5'- AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU-3'；W及沈Q ID N0:2所示miR-520c-5p的 序列： 5'- CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC-3'； 所述 miR-520c 含量為 0.1-lOg/ml。
[0010] 根據(jù)上述方案，進(jìn)一步包括:所述的載體選自膽固醇、納米顆粒、腺病毒和脂質(zhì)體 中的一種或多種;所述病毒選自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等中的一種或多 種；所述輔料選自PEG-PLA、PEG-DSPE、PEG-P化、PLGA等中的一種或多種。
[0011] 根據(jù)上述方案，進(jìn)一步包括:所述的藥物組合W 口服或注射方式給藥。
[0012] 根據(jù)上述方案，進(jìn)一步包括:所述注射方式為靜脈注射或肌肉注射。
[001引一種用于診斷或預(yù)后實(shí)體瘤試劑盒，所述試劑盒中含有miR-520c、生理鹽水和緩 沖液： 所述miR-520c核巧酸序列為SEQ ID N0:1所示的miR-520c-3p的序列：5'- AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU-3'；W及SEQ ID N0:2所示miR-520c-5p的序列：5'- CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC-3'； 所述生理鹽水為濃度0.9%氯化鋼生理鹽水； 所述緩沖液為化is-肥1緩沖液、PIPES緩沖液、GOOD'S緩沖液中的一種或多種的組 厶 1=1 一種上述的藥物組合物或上述的試劑盒在制備用于診斷或預(yù)后實(shí)體瘤中的用途。
[0014] 根據(jù)上述方案，進(jìn)一步包括:所述實(shí)體瘤選自鱗狀細(xì)胞癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，乳 頭狀腺癌，惡性多形性腺瘤中的一種或多種。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-520c在鱗狀細(xì)胞癌和乳頭狀腺癌 中表達(dá)顯著下調(diào)，并與腫瘤患者的分期，轉(zhuǎn)移W及預(yù)后相關(guān)。通過構(gòu)建miR-520c過表達(dá)和荷 瘤小鼠中過表達(dá)miR-520c的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-520c過表達(dá)在細(xì)胞水平能抑制細(xì)胞增殖與遷 移，荷瘤小鼠中過表達(dá)miR-520c與對照組相比腫瘤大小與腫瘤重量有了明顯的降低，同時(shí) 腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)與對照組相比有了明顯的降低。
[0016] 具體的，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miR-520c在腫瘤細(xì)胞與正常對照相比有了明顯的下降，對腫 瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移與對照組相比都有了明顯的下降。荷瘤小鼠 miR-520c過表達(dá)小鼠在 腫瘤體積，腫瘤大小，小鼠體重方面與野生型相比都有了明顯的降低。W上實(shí)驗(yàn)說明miR- 520c能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，運(yùn)意味了 miR-520c可作為一種早期診斷 和早期預(yù)防腫瘤的生物標(biāo)志。
[0017] W上實(shí)驗(yàn)說明miR-520c通過抑制鱗狀細(xì)胞癌和乳頭狀腺癌細(xì)胞增殖對腫瘤生長 具有保護(hù)作用，它對許多腫瘤疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值，可稱為一種治療腫瘤的藥 物。具體的，可W合成miR-520c的核巧酸并與適當(dāng)載體如膽固醇，納米顆粒，腺病毒，脂質(zhì)體 等連接形成藥物，通過口服，靜脈或肌肉注射的方式，對鱗狀細(xì)胞癌和乳頭狀腺癌等腫瘤疾 病進(jìn)行治療。
【附圖說明】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0019] 圖1為miR-520c在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)比較。
[0020] 圖2為miR-520c在不同腫瘤分期中的表達(dá)比較。
[0021] 圖3為miR-520c在腫瘤患者轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移中的比較。
[0022] 圖4為miR-520c在腫瘤患者預(yù)后中表達(dá)比較。
[0023] 圖5為miR-520c過表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖中與對照組相比抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
[0024] 圖6為miR-520c過表達(dá)在腫瘤細(xì)胞遷移中與對照組相比抑制腫瘤細(xì)胞遷移。
[00巧]圖7為荷瘤小鼠中miR-520c過表達(dá)，與對照組在檢測腫瘤體積大小中的比較。
[00%]圖8為荷瘤小鼠中miR-520c過表達(dá)，與對照組在腫瘤重量大小中的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明 除非特別指明，W下實(shí)施例中所用的小鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。
[002引除非特別指明，W下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域中所用的常規(guī)方法。
[0029] 除非特別指明，W下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可W從正規(guī)渠道 商購獲得 實(shí)驗(yàn)例1 miR-520c在腫瘤組織W及不同腫瘤分期中的表達(dá)情況檢測 ①選擇2010年10月至2014年6月我院病理資料保存完整的腫瘤患者85例，年齡35-76， 平均50.8歲，所有患者均經(jīng)病理檢查確診，均無其他重要臟器合并癥或腫瘤所有研究對象 均知情同意。收集手術(shù)切除的新鮮正常組織，腫瘤組織W及腫瘤患者的病理切片，腫瘤組織 采用TrizoKinvitrogen)，病理切片使用mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion，按照標(biāo) 準(zhǔn)操作步驟)提取RNA，使用RIPA裂解液提取組織中的蛋白。RNA濃度與純度和蛋白質(zhì)濃度采 用化och(BioTeck)分光光度計(jì)檢測。
[0030] ②通過Q-PCR檢測miR-520c在腫瘤組織中的表達(dá)變化。提取的RNA用Reved AidTM First Strand cDNA Synthesis KiUF'ermen^s)，按照操作說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用 ABI- Vii7 Real-time