含2,4-二硝基苯磺?；愣顾仡惢衔锛捌渲苽浞椒ㄅc應(yīng)用
【專利說明】含2，4-二硝基苯磺?；愣顾仡惢衔锛捌渲苽浞椒ㄅc應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及巰基蛋白質(zhì)的檢測領(lǐng)域，具體地說，是一種含2,4_二硝基苯磺?；?豆素類化合物及其制備方法與應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)上的巰基由于其易被活性氧化物或活性氮分子氧化，可以在氧化態(tài) 的疏基(-SH)和還原態(tài)的二硫鍵(S-S)間相互轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化還原平衡， 信號傳導(dǎo)等方面具有很重要的生理學(xué)意義。此外，含巰基蛋白質(zhì)的表達(dá)與多種疾病有關(guān)，例 如癌癥，糖尿病，神經(jīng)退性形變。因此，選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)的巰基蛋白具有重要的意義。
[0003] 熒光法由于其靈敏度高、選擇性好、操作過程簡單，且可用于活體成像等優(yōu)點在很 多領(lǐng)域廣受關(guān)注。香豆素?zé)晒鈭F(tuán)具有熒光量子產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好等特性，是一種常用的熒光 團(tuán)。此類熒光團(tuán)的熒光量子產(chǎn)率隨溶劑極性的變化而變化，通常在水溶液中熒光量子產(chǎn)率 較低，而在非極性溶劑中熒光量子產(chǎn)率較高，因此常用于制備極性敏感的熒光探針。2,4_二 硝基苯磺?；且环N比較常見的熒光猝滅基團(tuán)，但其易被含巰基的化合物取代，常常用作 熒光探針的受體單元用于檢測小分子硫醇。本發(fā)明將2,4_二硝基苯磺酰基通過共價鍵連接 到極性敏感的香豆素?zé)晒鈭F(tuán)上，只有當(dāng)熒光分子中的受體被硫醇取代且化合物同時處于非 極性環(huán)境中，體系的熒光才會有明顯的增強(qiáng)，利用此特性可以將巰基蛋白與小分子硫醇以 及其它不含自由巰基的蛋白質(zhì)區(qū)分開，從而實現(xiàn)對巰基蛋白的特異性響應(yīng)。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] 本發(fā)明的目的在于檢測含疏水空腔的疏基蛋白質(zhì)，排除不含自由疏基蛋白質(zhì)以及 小分子硫醇的干擾，提供一種含2，4-二硝基苯磺?；愣顾仡惢衔锛捌湓趲€基蛋白質(zhì)檢 測中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0006] -種含2，4-二硝基苯磺?；愣顾仡惢衔?，其結(jié)構(gòu)通式：
[0007]
[0008] 式中：κ為氧，m取代的烷基，生物素 ，嗎卩林，匍甸糖或者·采糖；2，4-二硝基苯磺酰 基在幾基的鄰、間和對位。
[0009] -種含2，4-二硝基苯磺?；愣顾仡惢衔锏暮铣煞椒?，其具體步驟為：
[0010] (1)將溶劑，3-甲氧基苯胺，碳酸鉀，碘化鈉，四丁基溴化銨TBAB以及溴乙烷加入到 反應(yīng)器中，將混合物加熱回流4~10小時后，真空旋蒸去除溶劑;反應(yīng)產(chǎn)物過硅膠柱，得無色 油狀物1;
[0011]所述的溶劑為乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氫呋喃或二甲基亞砜；
[0012] 3-甲氧基苯胺和碳酸鉀的摩爾比為1:1~1: 3,優(yōu)選為1:1.5; 3-甲氧基苯胺和碘化 鈉的摩爾比為1:0.05~1:0.15,優(yōu)選為1:0.1 ;3_甲氧基苯胺和四丁基溴化銨TBAB的摩爾比 為1:0.05~1:0.2,優(yōu)選為1:0.1 ;3_甲氧基苯胺和溴乙燒的摩爾比為1:0.8~1:1.5,優(yōu)選為 1:1; 3-甲氧基苯胺以及溴乙烷二者混合物與溶劑的固液比為7~9:45~55，優(yōu)選為3:80; [0013] (2)將步驟(1)得到的無色油狀物1和Cs 2C03置于有機(jī)溶劑中攪拌加熱回流;當(dāng)溶液 回流5~30min后再逐滴加入1，2-二溴乙烷，繼續(xù)反應(yīng)5~36小時；反應(yīng)液冷卻后抽慮，收集 濾液旋干，過硅膠柱，得無色油狀物2;
[0014] 無色油狀物和CS2CO3的摩爾比為1:1~1:3,優(yōu)選為1:1.5;無色油狀物1和1，2_二溴 乙燒的摩爾比為1:5~1:20,優(yōu)選為1:10;
[0015] (3)將步驟(2)得到的無色油狀物2加入無水有機(jī)溶劑中，氮氣保護(hù)，-10°C~-78°C 下逐步滴加三溴化硼的無水二氯甲烷溶液，反應(yīng)10~60min后緩慢升溫至室溫繼續(xù)反應(yīng)3~ 24h;冰浴下加水猝滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清 洗，清洗后旋干過硅膠柱，得無色油狀物3;
[0016] 無色油狀物2和三溴化硼的摩爾比為1:1~1:10,優(yōu)選為1:2.5;無色油狀物2和二 氯甲烷的摩爾體積比為1:5~1:20，優(yōu)選為1:10;
[0017] (4)在氮氣保護(hù)，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有機(jī)溶劑中，保持冰浴反應(yīng)15~ 45min，再向上述溶液滴加含步驟(3)得到的無色油狀物3的有機(jī)溶劑溶液，冰浴下反應(yīng)10~ 45min后移至室溫反應(yīng)5~45min，而后加熱至50~90°C反應(yīng)2~8h，加水猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯 萃取，保留有機(jī)相;有機(jī)相依次用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水清洗，清洗后旋干過硅膠柱， 得白色固體4;
[0018] 三氯氧磷和溶劑的摩爾體積比為15:1~1:1，優(yōu)選為8.25:1;無色油狀物2和溶劑 的摩爾體積比為10:1~1:1，優(yōu)選為4.1:1;
[0019] 所述的溶劑為乙腈或N，N_二甲基甲酰胺或四氫呋喃或二甲基亞砜。
[0020] (5)步驟(4)得到的白色固體4和丙二酸二乙酯溶于無水有機(jī)溶劑-哌啶中，回流反 應(yīng)4~12h后旋干溶劑;再加入濃鹽酸和冰醋酸于反應(yīng)物中，其中，加熱回流反應(yīng)4~12h，反 應(yīng)液自然冷卻至室溫;冰浴下，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至4~6，抽慮，得淡黃色 固體5;
[0021] 白色固體4和丙二酸二乙酯的摩爾比為1:0.5~1:3,優(yōu)選為1:1.2;白色固體4和溶 劑的摩爾體積比為1:1~1:100,優(yōu)選為1:12.5;哌啶和溶劑的體積比為1:10~1:300,優(yōu)選 為 1:100;
[0022]白色固體4和混酸的摩爾體積比為1:1~1: 50,優(yōu)選為1: 5;濃鹽酸和冰醋酸的體積 比為1:0.1~1:10,優(yōu)選為1:1;
[0023] 所述的溶劑為乙腈或乙醇或N，N-二甲基甲酰胺或四氫呋喃或二甲基亞砜；
[0024] (6)在氮氣保護(hù)，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有機(jī)溶劑中，保持冰浴反應(yīng)15~ 45min，再向上述溶液滴加含步驟(5)得到的淡黃色固體5的有機(jī)溶劑溶液，冰浴下反應(yīng)10~ 45min后移至室溫反應(yīng)5~45min，而后加熱至50~90°C反應(yīng)2~8h，加水猝滅反應(yīng)，乙酸乙酯 萃取，保留有機(jī)相;有機(jī)相依次用飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗，清洗后旋干過硅膠柱，得 棕黃色固體6;
[0025] 三氯氧磷和有機(jī)溶劑的體積比為1:0.5~1:10，優(yōu)選為1:3;
[0026] 淡黃色固體5和有機(jī)溶劑的摩爾體積比為1:0.1~1:10,優(yōu)選為1:1;
[0027] (7)將步驟(6)得到的棕黃色固體6,疊氮化鈉和碘化鈉溶于有機(jī)溶劑中，氮氣保護(hù) 下于60~90 °C反應(yīng)6~12h后，向反應(yīng)液中加入冰水，抽慮得棕黃色固體7;
[0028]棕黃色固體6和有機(jī)溶劑的摩爾體積比為1:0.1~1:10,優(yōu)選為1:1;棕黃色固體6 和疊氮化鈉的摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為1:5;棕黃色固體6和碘化鈉的摩爾比為1:0.05 ~1:10,優(yōu)選為1:0.1;
[0029] 棕黃色固體6和冰水的摩爾體積比為1:10~1:100,優(yōu)選為1:23;
[0030] (8)將步驟(7)得到的棕黃色固體7溶于無水的混合有機(jī)溶劑中，攪拌下分別加入 4-羥基苯乙酮和吡咯烷，室溫反應(yīng)24~48h，旋干反應(yīng)液;再加入1~10L的石油醚，抽慮，得 紅色固體8;
[0031] 棕黃色固體7和有機(jī)溶劑的摩爾體積比為1:1~1:100,優(yōu)選為1:20;棕黃色固體7 和4-羥基苯乙酮的摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為1:1.8;吡咯烷用量為0.5~lOOrnL;
[0032] (9)將步驟(8)得到的紅色固體8加入到有機(jī)溶劑中，氮氣保護(hù)下滴加三苯基磷的 有機(jī)溶劑溶液，55~75 °C反應(yīng)4~8h后加入水，繼續(xù)反應(yīng)8~15h，旋干反應(yīng)液，過硅膠柱，得 紅色固體9;
[0033] 其中，紅色固體8和有機(jī)溶劑的摩爾體積比為1:1~1:100,優(yōu)選為1:40;紅色固體8 和三苯基磷的摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為1:1.5;
[0034] (10)將D-生物素，1-羥基苯并三唑Η0ΒΤ和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽EDC.HC1溶于有機(jī)溶劑中，向上述體系滴加三乙胺，室溫下反應(yīng)10~45min后加入步 驟(9)得到的紅色固體9，繼續(xù)反應(yīng)2~6h;加入1~10L飽和食鹽水，抽慮，將所得紅色固體溶 于1~10L二氯甲烷中，分別用飽和碳酸氫銨，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗，清洗后旋干 有機(jī)相過硅膠柱，得紅色固體10;
[0035] D-生物素和有機(jī)溶劑的摩爾體積比為1:1~1: 50,優(yōu)選為1: 20;D-生物素和Η0ΒΤ的 摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為1:1.2;D-生物素和EDC.HC1的摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為 1:1.2 ;D-生物素和三乙胺的摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為1:1.8;
[0036] D-生物素和紅色固體9的摩爾比為1:0.5~1:10,優(yōu)選為1:1;
[0037] (11)將步驟（10)得到的紅色固體10,乙胺溶于有機(jī)溶劑中，氮氣保護(hù)，冰浴下緩 慢滴加2,4_二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，繼續(xù)反應(yīng)2~5h，旋干有機(jī)相過硅膠柱，得目 標(biāo)產(chǎn)物；
[0038] 紅色固體10和2,4_二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1:0.8~1:2,優(yōu)選1:1.2;紅色固體 10和乙胺的摩爾比為1:0.8~1:2,優(yōu)選1:1.2;紅色固體10和有機(jī)溶劑的摩爾體積比為1:1 ~1:100,優(yōu)選為1:40; 2，4_二硝基苯磺酰氯和二氯甲烷的摩爾體積比為1:1~1:100,優(yōu)選 為 1:10;
[0039] -種含2，4-二硝基苯磺?；愣顾仡惢衔镌趲€基蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用，其具體 步驟為：
[0040] (1)制備含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的二甲亞砜DMS0溶液，為儲備液1;
[0041 ] (2)制備半胱氨酸和卵清白蛋白0VA的水溶液分別為儲備液2和儲備液3;
[0042] (3)準(zhǔn)確移取10L儲備液1至10mL的容量瓶內(nèi)，用不同比例的乙腈與20mM的磷酸鹽 緩沖液(pH=7.4)稀釋至刻度待用；移取3mL上述溶液至比色皿中，加入10~30mL的儲備液 3