一種仿病毒結構高分子囊泡及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子材料領域，涉及一種仿病毒結構高分子囊泡，具體涉及一種仿病毒核衣殼及表面刺突結構的高分子囊泡及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]病毒作為結構最簡單的一類非細胞型微生物，主要由核酸分子和蛋白衣殼組成；其基本結構有核心(核酸)和衣殼(蛋白或脂蛋白)，二者構成核衣殼。病毒特有的衣殼結構能屏蔽體內循環(huán)環(huán)境中的潛在破壞因素，如核酸酶、酸堿度等，具有保護基因遺傳物質的功能。有些病毒粒子表面(尤其是在有囊膜的病毒粒子表面)有呈放射排列的突起物，稱刺突(也稱囊膜突起)。這些刺突有的是病毒的凝血素(能凝集紅細胞)，用于起動病毒感染過程，具有誘生免疫保護作用以及中和抗體的能力;有的具有神經(jīng)氨酸酶的活力，可促使病毒從宿主細胞上釋放。
[0003]受病毒結構和功能的啟發(fā)，一直以來各種仿病毒人工自組裝納米聚集體的不斷出現(xiàn)，其中以仿病毒結構的脂質體囊泡和高分子囊泡最為典型。它們都是由一類由雙親性分子有序組合而成的中空球體;其球體的外殼膜層由雙親性分子構成，內部的親水空腔可以用于包裹藥物。在水溶液中，囊泡的膜可分為三層:兩個內外側的親水層和一個處于內外親水層中的疏水層，疏水層由于內外表面的親水層而保持穩(wěn)定。相比于由磷脂小分子自組裝形成的脂質體囊泡，高分子囊泡是由大分子量的兩親性嵌段共聚物組成，其類病毒“核衣殼”的衣殼膜的納米結構具有更高的穩(wěn)定性。通過嵌段共聚物設計與合成，可在尺度上實現(xiàn)從微觀到宏觀調控，可對高分子鏈進行功能基團接枝修飾實現(xiàn)高分子囊泡的特定功能性設計。此外，納米級(200nm以下)的高分子囊泡可以被細胞內吞，故可采用著名的特洛伊木馬(Troian Horse)策略，用高分子囊泡包裹藥物或基因片段等，避免體內循環(huán)環(huán)境中免疫系統(tǒng)辨識、吞噬，如核酸酶、酸堿度等。因此這類仿病毒結構高分子囊泡的結構和膜的特性給它帶來許多方面的潛在應用，比如高效納米載體、藥物控釋、納米反應器等，在多功能藥物載體的發(fā)展及生物醫(yī)學領域具有重要的現(xiàn)實意義和應用價值。目前，仿病毒核衣殼的高分子囊泡已經(jīng)有多種，但帶有表面刺突結構的高分子囊泡還未有公開報道。

【發(fā)明內容】

[0004]從天然病毒的基本結構和特征出發(fā)，本發(fā)明的目的在于提供一種可負載藥物、生物相容性好、易于被細胞吞噬的仿病毒核衣殼及表面刺突結構的高分子囊泡。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述仿病毒結構高分子囊泡的制備方法。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供上述仿病毒結構高分子囊泡的應用。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):
[0008]—種仿病毒結構高分子囊泡，主要由不同兩親性嵌段共聚物進行自組裝制備而成;或者由兩親性嵌段共聚物與水溶性聚合物進行自組裝制備而成;所述高分子囊泡具有衣殼膜結構和膜表面的刺突結構，所述衣殼膜結構的內層和外層由兩親性嵌段共聚物中親水鏈段或水溶性聚合物構成，所述內層和外層之間的中間層由兩親性嵌段共聚物中疏水鏈段構成;其結構示意圖如圖1所示。
[0009]所述囊泡的尺寸為50nm?15μηι。
[0010]所述仿病毒結構高分子囊泡還包括負載物。
[0011]所述不同兩親性嵌段共聚物中親水鏈段的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000?20000Da;所述不同兩親性嵌段共聚物中疏水鏈段的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000Da?10000Da；
[0012]所述兩親性嵌段共聚物中親水鏈段的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000?20000Da;所述兩親性嵌段共聚物中疏水鏈段的分子量之2000Da，優(yōu)選為2000Da?10000Da;
[0013]所述水溶性聚合物的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000Da?50000Da。
[0014]所述不同兩親性嵌段共聚物是指兩種或兩種以上兩親性嵌段共聚物。
[0015]所述不同兩親性嵌段共聚物中“不同”是指兩親性嵌段共聚物間嵌段比不同(親水鏈段分子量不同和/或疏水鏈段分子量不同)但親水鏈段和疏水鏈段種類相同，或者是指兩親性嵌段共聚物的嵌段種類不同。
[0016]所述不同兩親性嵌段共聚物中，當親水鏈段的分子量比為1:(0.8?1.2)時，疏水鏈段的分子量比為1: (2?50);當疏水鏈段的分子量比為1: (0.8?1.2)時，親水鏈段的分子量比為1:(2?10)。
[0017]所述不同兩親性嵌段共聚物優(yōu)選為兩種兩親性嵌段共聚物，分別為低分子量嵌段共聚物Ax1-b-Byi與尚分子量嵌段共聚物Ax2-b_By2;當未水鏈段分子量比xl/x2為1: (0.8?1.2)時，疏水鏈段分子量比yl/y2為I: (2?50);當疏水嵌段分子量比yl/y2為1: (0.8?1.2)時，親水鏈段分子量比xl/x2為1: (2?10)。
[0018]所述低分子量嵌段共聚物Ax1-b-Byi與高分子量嵌段共聚物AX2-b-By2的質量比為1:(0.1?I)。
[0019]所述兩親性嵌段共聚物中親水鏈段為聚乙二醇(PEG)、聚2-甲基丙烯酸乙氧基磷酸膽堿(PMPC)中的一種，所述疏水鏈段為聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚2-二異丙胺基乙基甲基丙烯酸酯(PDPA)中的一種。
[0020]所述兩親性嵌段共聚物優(yōu)選為PEG-b-PLA，PEG-b-PCL，PEG_b_PDPA 或 PMPC_b_PDPA中的一種以上。
[0021]所述兩親性嵌段共聚物PEG-b-PLA的合成方法為:將PEG、丙交酯(PEG和丙交酯的摩爾比為1:(0.2?5))和催化劑辛酸亞錫(PEG:辛酸亞錫的質量比= 1000/1)—起加入有機溶劑(如:甲苯，二甲苯)中，氮氣氛下于110?160 °C恒溫反應12?24h，然后沉析，抽濾，真空干燥后即得PEG-b-PLA嵌段共聚物。
[0022]所述兩親性嵌段共聚物PEG-b-PCL的合成方法為:將PEG加入有機溶劑(如:甲苯，二甲苯)中，加入催化劑辛酸亞錫(PEG:辛酸亞錫的質量比= 1000/1)，氮氣氛下，緩慢加入己內酯(PEG和己內酯單體的摩爾比為1: (0.2?5))，于110?160°C恒溫反應12?48h，然后減壓旋蒸，沉析，抽濾，真空干燥后即得PEG-b-PCL嵌段共聚物。
[0023]所述兩親性嵌段共聚物PEG-b-H)PA的合成方法為:將2-二異丙胺基乙基甲基丙烯酸酯(DPA)單體、大分子引發(fā)劑PEG-Br、催化劑CuBr和2，2/-聯(lián)吡啶(2，2-1^?74(^1^)按摩爾比(20?30): (I?2):1:2加入到有機溶劑(甲醇、異丙醇、或甲醇-異丙醇)中，氮氣氛下于40?60°C反應12?24h，然后沉析，然后通過水洗去催化劑，之后凍干，得到PEG-b-roPA嵌段共聚物。
[0024]所述兩親性嵌段共聚物PMPC-b-PDPA的合成方法為:將2-甲基丙烯酸乙氧基磷酸膽堿(MPC)單體、引發(fā)劑(OEG-Br)、催化劑CuBr、2，2'-聯(lián)吡啶按摩爾比(25?30): 1: 1: 2加入至押醇中，氮氣氛下于20°C恒溫反應2h，得到PMPC聚合物，之后在反應液中繼續(xù)加入2-二異丙胺基乙基甲基丙烯酸酯(DPA)單體(MPC:DPA單體摩爾比為1: (1.5?3))，反應40h，然后在THF中沉析，再溶解在水中，然后凍干即得PMPC-b-PDPA嵌段共聚物。
[0025]當仿病毒結構高分子囊泡由兩親性嵌段共聚物與水溶性聚合物進行自組裝制備而成時，所述兩親性嵌段共聚物中親水鏈段分子量與水溶性聚合物分子量比為1: (2?10);所述兩親性嵌段共聚物與水溶性聚合物的質量比為1: (0.1?5)，優(yōu)選為1: (0.1?I)。
[0026]所述水溶性聚合物的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000Da?50000Da。
[0027]所述水溶性聚合物為聚乙二醇(PEG)，水溶性淀粉衍生物(如羧甲基淀粉)、植物膠、動物膠、水溶性纖維素衍生物(如羥甲基纖維素、羧甲基纖維素)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚多肽。
[0028]所述負載物為藥物、抗體、蛋白、基因片段、熒光分子或生長因子;所述藥物優(yōu)選為阿霉素(DOX);所述抗體優(yōu)選為帕尼單抗(Vectibix)、T-DMl (Kadcyla)、抗體immunoglobulin G ;所述蛋白優(yōu)選為小牛血清蛋白(BSA);所述的焚光分子為羅丹明(Rhodamine)、尼羅紅(Nile red)、藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸焚光素(FITC)。
[0029]所述仿病毒結構高分子囊泡的制備方法，具體步驟為:
[0030](I)高分子溶液的制備:將不同的兩親性嵌段共聚物或兩親性嵌段共聚物和水溶性聚合物加入到有機溶劑中，攪拌混勻，得高分子溶液；
[0031 ] (2)高分子溶液的處理:去除高分子溶液中有機溶劑，并加入水或PBS緩沖溶液，得到仿病毒結構高分子囊泡;或者去除高分子溶液中有機溶劑，加入負載物與水或PBS緩沖溶液，得到負載有負載物的仿病毒結構高分子囊泡。
[0032]步驟(I)所述攪拌的轉速為100?800r/min，攪拌時間為0.05?6h。
[0033]步驟(2)所述高分子溶液的處理有以下兩種處理方式:第一種處理方式具體包括以下步驟:在攪拌條件下，將水或PBS緩沖溶液與高分子溶液混合，得混合乳液;透析或繼續(xù)攪拌去除有機溶劑，得到仿病毒結構高分子囊泡;或將負載物與水或PBS緩沖溶液加入高分子溶液中，繼續(xù)攪拌，得到負載有負載物的仿病毒結構高分子囊泡。所述繼續(xù)攪拌時間都為5?72h、整個反應的攪拌轉速為100?700r/min，所述透析時間都為24?96h。
[0034]步驟(2)所述高分子溶液的處理的第二種處理方式具體包括以下步驟:將步驟I)的高分子溶液進行干燥，得到復合薄膜;將水或PBS緩沖溶液加入裝有復合薄膜的裝置中，攪拌，得到仿病毒結構高分子囊泡;或將負載物與水或PBS緩沖溶液加入裝有復合薄膜的裝置中，攪拌，得到負載有負載物的仿病毒結構高分子