利用兩輪加菌共培養(yǎng)提高小球藻產(chǎn)量的方法和制備生物飼料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用兩輪加菌共培養(yǎng)提高小球 藻產(chǎn)量的方法和制備生物飼料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小球藻是一種單細(xì)胞綠藻，其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，易于大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞中含有豐富的 營養(yǎng)物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于保健食品、飼料、食品添加劑、精細(xì)化加工品和作為醫(yī)藥制劑原料，其 開發(fā)利用已經(jīng)引起國內(nèi)外廣泛的重視。我國常見的小球藻種類有蛋白核小球藻、楠圓小球 藻、普通小球藻等，其中蛋白核小球藻藻粉粗蛋白核必需氨基酸含量高，是一種優(yōu)良的飼料 蛋白源(李國平.蛋白核小球藻粉中氨基酸含量和飼用價(jià)值分析.中國野生植物資源.2003， 22(2) :23-25)。蛋白核小球藻還可W清除廢水中不同形態(tài)的氮和憐，可用于工廠化水產(chǎn)養(yǎng) 殖廢水的凈化處理(陳海敏等，工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水菌藻聯(lián)合處理模式研究.浙江樹人大學(xué) 學(xué)報(bào)，2002,2(4) :64-67),還能利用偶氮染料為唯一氮源和碳源生長，對(duì)印染廢水中的偶氮 染料具有較強(qiáng)的脫色能力(鄭金來等，生物降解常見染料的研究進(jìn)展.環(huán)境污染治理技術(shù)與 設(shè)備，2000，1 (3): 39-43)。因此，如何在提高細(xì)胞生長速率，短時(shí)間內(nèi)獲得大量的藻細(xì)胞是 開發(fā)應(yīng)用蛋白核小球藻的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。
[0003] 已有研究表明微藻和微生物之間存在從寄生到共生等廣泛的互作現(xiàn)象，某些微生 物對(duì)藻細(xì)胞的生長代謝影響顯著某些微生物對(duì)藻細(xì)胞的生長代謝影響顯著，能促進(jìn)藻細(xì)胞 生長和生化組分的積累[Ueda H,et al.Bacterial communities constructed in 曰rtifici曰I consorti曰 of b曰cteri曰曰nd Chlorell曰 vulg曰ris.Microbes Environment, 2010,25(1) :36-40.]。植物內(nèi)生菌是能夠定殖在健康植物內(nèi)，并與宿主植物建立和諧共生 關(guān)系的一類微生物。水稻植株含有許多內(nèi)生微生物，是重要的內(nèi)生細(xì)菌資源，來源于水稻植 株的內(nèi)生泛菌可W顯著促進(jìn)宿主水稻的生長，提高其生物量、葉綠素及憐含量的生物學(xué)作 用（FengY,et al.Rice endophyte Pantoea agglomeransYS19promotes hostplant growth and affects allocations of hostphotosynthates. Journal ofApplied Microbiology，2006，100(5):938-945.劉佳，等.內(nèi)生成團(tuán)泛菌HAUMl對(duì)宿主水稻的定殖及 促生作用.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50 (23): 4820-4824.)。由于小球藻與植物細(xì)胞一樣具有葉 綠體，能夠進(jìn)行光合作用，其生化代謝特征與植物具有相似性，理論上，對(duì)植物具有代謝調(diào) 節(jié)作用的植物內(nèi)生菌也能影響小球藻的生長和代謝活動(dòng)，但迄今國內(nèi)外未見采用包括水稻 內(nèi)生菌在內(nèi)的植物內(nèi)生菌促進(jìn)小球藻生長及生化組分合成積累的技術(shù)研究和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種利用兩輪加菌共培養(yǎng)提高小球藻產(chǎn)量的方法和制備生物飼料 的方法，應(yīng)用水稻內(nèi)生泛菌進(jìn)行兩輪菌藻共培養(yǎng)，達(dá)到快速增加小球藻生長速率的目的效 果。
[0005] -種利用兩輪加菌共培養(yǎng)提高小球藻產(chǎn)量的方法，包括：
[0006] 1)將第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻在光照下進(jìn)行第一輪菌藻共培養(yǎng)，培養(yǎng) 結(jié)束后，得到第一輪菌藻共培養(yǎng)液；
[0007] 2)在第一輪菌藻共培養(yǎng)液中再補(bǔ)加第二次加入的水稻內(nèi)生泛菌，在光照下進(jìn)行第 二輪菌藻共培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，得到第二輪菌藻共培養(yǎng)液；
[0008] 3)對(duì)第二輪菌藻共培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞分離，得到小球藻細(xì)胞沉淀和內(nèi)含水稻內(nèi)生泛 菌的上清菌液。
[0009] W下作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案：
[0010] 步驟1)中，所述的第一輪菌藻共培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)條件均為23°c~33°C，光強(qiáng) 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻 2~6次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為6~12天。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第一輪菌藻共培養(yǎng)的 條件為:培養(yǎng)條件均為28°C，光強(qiáng)2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天 搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻4次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為8天。
[0011] 所述的第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻的菌藻比為1~10000:1，在一定范圍 內(nèi)，水稻內(nèi)生泛菌的比例越高，越能夠促進(jìn)小球藻的生長，越能夠提高小球藻產(chǎn)量。進(jìn)一步 優(yōu)選，所述的第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌和小球藻的菌藻比為10~1000:1。
[0012] 所述的水稻內(nèi)生泛菌可采用市售產(chǎn)品，可采用中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中屯、(ACCC)出 售的編碼為10454的水稻內(nèi)生泛菌菌種。
[0013] 所述的小球藻可W為蛋白核小球藻，也可采用市售產(chǎn)品，可采用中國科學(xué)院野生 生物種質(zhì)庫淡水藻種庫(FACHB)市售的編號(hào)為FACHB-1222的蛋白核小球藻。
[0014] 步驟2)中，所述的第二輪菌藻共培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)條件均為23°C~33°C，光強(qiáng) 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻 2~6次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為2~12天。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第二輪菌藻共培養(yǎng)的 條件為:培養(yǎng)條件均為28°C，光強(qiáng)2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養(yǎng)，每天 搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻4次直至培養(yǎng)周期結(jié)束，培養(yǎng)周期為4~8天。
[0015] 所述的第二次加入的水稻內(nèi)生泛菌和第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌的比為0.25~ 4:1。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的第二次加入的水稻內(nèi)生泛菌和第一次加入的水稻內(nèi)生泛菌的比為 1:1，能夠更好地促進(jìn)小球藻的生長，越能夠提高小球藻產(chǎn)量。
[0016] 步驟3)中，所述的細(xì)胞分離包括:第二輪菌藻共培養(yǎng)液先在超聲波條件下處理，之 后離屯、，得到小球藻細(xì)胞沉淀和內(nèi)含水稻內(nèi)生泛菌的上清菌液。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的超聲波條件為:在140W~180W、30kHz~50kHz超聲波條件下處 理15s~45s。所述的離屯、為在1000~140化/min低速離屯、3~IOmin。更進(jìn)一步優(yōu)選，所述的 超聲波條件為:在160W、40曲Z超聲波條件下處理30s。所述的離屯、為在1200r/min低速離屯、 5min。在160W、40曲Z超聲波條件下處理30s，使水稻內(nèi)生泛菌細(xì)胞和小球藻細(xì)胞發(fā)生分離， 120化/min低速離屯、5min，使較大的小球藻細(xì)胞沉淀下來而較小的水稻內(nèi)生泛菌仍懸浮上 清中，分別收集沉淀中的小球藻細(xì)胞和上清中的水稻內(nèi)生泛菌細(xì)胞。
[0018]本發(fā)明中，小球藻細(xì)胞沉淀經(jīng)洗涂重懸后可作為水中偶氮染料降解等污水凈化處 理的生物基料，也可經(jīng)干燥后獲得蛋白核小球藻細(xì)胞產(chǎn)品，作為制備飼料、提取油脂、蛋白、 色素和生長因子等相關(guān)生物產(chǎn)品的原料。
[0019] 小球藻細(xì)胞沉淀經(jīng)處理后得到小球藻細(xì)胞干品，所述的處理包括:洗涂、離屯、和干 燥，將小球藻細(xì)胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經(jīng)6000~100(K)r/min離屯、5~20min后收集， 之后在30°C~50°C低溫條件下烘干，得到小球藻藻細(xì)胞干品。進(jìn)一步優(yōu)選，將小球藻細(xì)胞沉 淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經(jīng)8000r/min離屯、IOmin后收集，之后在40°C低溫條件下烘干，得 到小球藻藻細(xì)胞干品。
[0020] -種制備生物飼料的方法，包括：
[0021] 1)根據(jù)所述的利用兩輪加菌共培養(yǎng)提高小球藻產(chǎn)量的方法制備得到小球藻細(xì)胞 沉淀；
[0022] 2)將小球藻細(xì)胞沉淀經(jīng)洗涂、離屯、和干燥后得到小球藻細(xì)胞干品，將小球藻細(xì)胞 干品制成生物飼料。
[0023] 所述的洗涂、離屯、和干燥具體為：將小球藻細(xì)胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經(jīng) 6000~lOOOOr/min離屯、5~20min后收集，之后在30°C~50°C低溫條件下烘干，得到小球藻 藻細(xì)胞干品。進(jìn)一步優(yōu)選，將小球藻細(xì)胞沉淀加入蒸饋水重懸洗涂后，經(jīng)8000r/min離屯、 IOmin后收集，之后在40°C低溫條件下烘干，得到小球藻藻細(xì)胞干品。
[0024] 小球藻細(xì)胞干品可直接制作為藻生物飼料，也可W將小球藻細(xì)胞干品添加到飼料 配方中，得到復(fù)合生物飼料。
[0025] 本發(fā)明補(bǔ)菌增藻技術(shù)的機(jī)理在于:在菌藻互作的共培養(yǎng)過程中，由于采用的是小 球藻適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，共生細(xì)菌能夠促進(jìn)微藻的生長，相反，微藻可能產(chǎn)生細(xì)菌生 長抑制物質(zhì)，如綠藻素等抑制菌細(xì)胞的增殖，如此隨著培養(yǎng)周期的延長，菌藻培養(yǎng)液中藻細(xì) 胞呈逐漸增長趨勢(shì)，而菌細(xì)胞數(shù)量則逐漸衰減，會(huì)越來越少，最后菌藻培養(yǎng)體系中只有極少 量的菌細(xì)胞存活。因此，菌對(duì)藻的增殖促進(jìn)作用在一定范圍內(nèi)隨接種菌藻比的增大而增大， 而且在補(bǔ)菌初期的增藻效果比后期更為明顯，運(yùn)也是決定本發(fā)明所設(shè)定的接種菌藻比、共 培養(yǎng)周期時(shí)段長短和補(bǔ)菌接種時(shí)間的技術(shù)基礎(chǔ)。作為優(yōu)選，本發(fā)明W接種菌藻比10-1000: 1，首輪培養(yǎng)8天，第二輪及此后補(bǔ)菌共培養(yǎng)時(shí)間W4-8天為主，W達(dá)到理想的技術(shù)效果。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 本發(fā)明中，蛋白核小球藻活細(xì)胞沉淀經(jīng)洗涂重懸后可作為水中偶氮染料降解等污 水凈化處理的生物基料，也可經(jīng)干燥后獲得蛋白核小球藻細(xì)胞產(chǎn)品，作為制備飼料、提取油 月旨、蛋白、色素和生長因子