一種高致病性嗜水氣單胞菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及動(dòng)物疫苗技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種高致病性嗜水氣單胞菌及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜水氣單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，系氣單胞菌科氣單胞菌屬，普遍存在于淡水， 污水，渺泥，±壤和人畜糞便中，在自然界中廣泛分布。該菌可感染魚類、兩棲動(dòng)物、軟體動(dòng) 物，甚至鳥類、爬行類W及哺乳類等多種動(dòng)物，由其引發(fā)的感染或細(xì)菌性敗血癥可導(dǎo)致動(dòng)物 大量死亡。嗜水氣單胞菌是我國魚類養(yǎng)殖史中危害魚種類最多、魚齡范圍最大、分布區(qū)域最 廣、流行季節(jié)最長的一種重要急性傳染病。同時(shí)，該病原引發(fā)的感染廣泛分布于世界范圍 內(nèi)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖大國帶了經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)魚類一旦感染嗜水氣單胞菌發(fā)病速度極快，發(fā) 病魚通常表現(xiàn)為眼球突出，腹下出血，嚴(yán)重時(shí)腹部水腫膨脹。該菌的致病機(jī)理尚不十分清 楚，目前已知的在導(dǎo)致魚類感染過程中發(fā)揮重要作用的致病因子包括核酸酶、氣溶素、胞外 蛋白酶、腸毒素、溶血素等。
[0003] 由該菌引起的疾病主要W抗生素和化學(xué)藥物控制為主，但是抗生素和化學(xué)試劑過 量使用可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，并引起環(huán)境污染，甚至導(dǎo)致抗生素或化學(xué)試劑殘留引發(fā)食 品安全問題。因此，接種疫苗成為預(yù)防魚類病害的最重要手段。目前若干嗜水氣單胞菌滅活 疫苗已經(jīng)制備并被證實(shí)對特定菌株具有部分免疫保護(hù)效果，但由于嗜水氣單胞菌菌株有致 病性和非致病性菌株之分，所攜帶毒力因子具有多種組合，因此普遍認(rèn)為只有篩選帶有多 種毒力因子的強(qiáng)毒力菌株用于制備滅火疫苗才能更好保護(hù)水生生物抵抗不同嗜水氣單胞 菌致病菌株的感染。因此，篩選一株含有多種毒力因子的強(qiáng)毒力菌株，將其制備滅活疫苗顯 得尤為重要。
[0004] CN 105031636 A通過PCR方法篩選不同來源的菌株，將其中含有氣溶素(aerA)、腸 毒素(alt)、絲氨酸蛋白酶(ahp) W及溶血素(e-hly)四個(gè)毒力因子的一株菌株滅活，制備成 口服疫苗，獲得良好效果，能為銀娜提供相對保護(hù)率46.7 %。
[0005] 申請人通過篩選，獲得了一株至少具備5個(gè)毒力因子的高致病性嗜水氣單胞菌，經(jīng) 驗(yàn)證，該菌可作為商業(yè)疫苗進(jìn)行生產(chǎn)，具備廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于一種高致病性嗜水氣單胞菌，該菌株已于2015年12月29日送往 中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，分類命名：嗜水氣單胞菌(Aeromonas hy化ophi la)ZYAH72， 保藏編號:CCTCC NO: M2015797，地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種高致病性嗜水氣單胞菌在制備嗜水氣單胞菌 感染疫苗中的應(yīng)用，利用本發(fā)明提供的疫苗，可克服W往滅活疫苗保護(hù)效果不高和難W抵 抗不同致病菌株感染的弊端，該疫苗特別適用于水產(chǎn)動(dòng)物的由水氣單胞菌引起的嗜水氣單 胞菌性敗血癥。
[000引為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取W下技術(shù)措施：
[0009] -種高致病性嗜水氣單胞菌的獲得：
[0010] 申請人自發(fā)病或溯死的魚中，從患病部位劃線至TSB固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行致病菌的 篩選，通過革蘭氏染色鏡檢、16S rDNA測序、溶血實(shí)驗(yàn)、PCR擴(kuò)增嗜水氣單胞菌相關(guān)毒力基 因、斑馬魚半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)、小鼠半數(shù)致死實(shí)驗(yàn)，最終獲得了一株高致病性嗜水氣單胞菌， 該細(xì)菌已于該菌株已于2015年12月29日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，分類命名：嗜 水氣單胞菌(Aeromonas hy化ophila)ZYAH72,保藏編號：CCTCC N0:M2015797,地址：中國武 漢武漢大學(xué)。
[0011] 該菌株在血瓊脂平板上具有較強(qiáng)的溶血活性，含有氣溶素(aerA)，絲氨酸蛋白酶 (ahp)，溶血素化Iy),腸毒素(alt),金屬蛋白酶(ast)等五個(gè)毒力因子，在生化實(shí)驗(yàn)中呈氧 化酶、阿拉伯糖、屯葉巧、精氨酸雙水解酶、葡萄糖產(chǎn)氣、水楊素為陽性反應(yīng)，6%化Cl腺水為 陰性反應(yīng)。在普通TSB固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中生長良好，生長所需適宜溫度為28-3(TC。
[0012] -種高致病性嗜水氣單胞菌在制備嗜水氣單胞菌感染疫苗中的應(yīng)用，包括利用現(xiàn) 有方法將該菌制備為由水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性敗血癥疫苗，或其為有效成分 之一與其他疫苗制備為多聯(lián)疫苗。
[OOU]所述的水產(chǎn)動(dòng)物包括但不限于:草魚、娜、錦、館、賴、經(jīng)、青魚、羅非魚、媛綱、白娜、 銀娜、鑄、黃尾細(xì)、編、斑點(diǎn)叉尾綱、金魚、黃錯(cuò)、牙解等魚類;還包括蛙、大銳、郵、蟹、整、龜?shù)?水生動(dòng)物。
[0014] 本發(fā)明所述的嗜水氣單胞菌還可用于制備哺乳動(dòng)物的嗜水氣單胞菌感染疫苗，特 別是小鼠的嗜水氣單胞菌感染疫苗。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1、與通過抗生素和化學(xué)藥物防控該病原相比，疫苗具有成本低，特異性高，環(huán)境友 好型的特點(diǎn)。
[0017] 2、含有較多的毒力因子，可提供更多的有效免疫原。
[0018] 3、該菌株在活體中的致病性強(qiáng)于致病標(biāo)準(zhǔn)株，并且高于本實(shí)驗(yàn)室分離的其他菌 株。
[0019] 4、本疫苗不需要佐劑就能獲得較好的免疫效果，并能有效抵抗嗜水氣單胞菌的感 染。
[0020] 5、能夠?yàn)閹椭~類抵抗不同來源的嗜水氣單胞菌致病菌株的感染。
[0021] 6、疫苗的效果在魚類和哺乳動(dòng)物中均得到驗(yàn)證。
[0022] 7、使用本發(fā)明的疫苗，可W有效的預(yù)防由嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥，減 少魚類患病率和死亡率，從而減少淡水魚養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。
[0023] 8、使用本發(fā)明提供的疫苗，可顯著增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力，提高抗病表型。
【附圖說明】
[0024] 圖1為嗜水氣單胞菌ZYAH72溶血活性檢測示意圖。
[00巧]圖2為嗜水氣單胞菌ZYAH72的毒力因子PCR擴(kuò)增示意圖。
[00%]其中M:DNA Marker 2k，泳道 1-5依次為ae;r、alt、址p、ast、hly基因。
[0027] 圖3為嗜水氣單胞菌ZYAH72和致病標(biāo)準(zhǔn)株的毒力比較示意圖。
[0028] 圖4為嗜水氣單胞菌ZYAH72生長曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。所述試劑或材料， 如未特別說明，均來自于商業(yè)渠道。
[0030] 實(shí)施例1:
[0031 ] -種高致病性嗜水氣單胞菌的獲得：
[0032] (1)篩選具有多種毒力因子的強(qiáng)致病性嗜水氣單胞菌
[0033] A.在超凈臺中解剖發(fā)病或溯死的魚中，從患病部位劃線至TSB固體培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)1她-24h，挑取平板上單菌落轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基上純培養(yǎng);在TSB固體培養(yǎng)基上典型菌 落為圓形，淺黃色，半透明，表面光滑，濕潤，邊緣整齊的菌落。
[0034] B.取上述平板上純培養(yǎng)的單菌落，用法國梅里埃公司的API細(xì)菌鑒定試劑條進(jìn)行 生化鑒定(見表1 )，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌落形態(tài)。
[0035] 表1:分離株部分生理生化鑒定結(jié)果
[0037] C.擴(kuò)增候選菌株的16S rDNA并測序，在與數(shù)據(jù)庫中已有的嗜水氣單胞菌數(shù)據(jù)進(jìn)行 同源性比對，結(jié)果顯示其同源性為99%。
[0038] D.根據(jù)生理生化檢測，革蘭氏染色鏡檢菌落形態(tài)及16S rDNA測序結(jié)果確定分離的 菌株為嗜水氣單胞菌；
[0039] E.篩選能夠表達(dá)溶血素并具有溶血活性的菌株，本發(fā)明最終獲得的ZYAH72菌株的 溶血活性見圖1。
[0040] F.擴(kuò)增相關(guān)毒力基因，結(jié)果顯示本發(fā)明獲得的嗜水氣單胞菌ZYAH72菌至少具有氣 溶素(aerA)，絲氨酸蛋白酶(ahp)，溶血素化Iy)，熱穩(wěn)定腸毒素(ast)和細(xì)胞緊張性腸毒素 (alt)毒力因子，經(jīng)過篩選初步確定分離株ZYAH72為高致病性嗜水氣單胞菌(見圖2)。
[0041 ] 將該菌株的日日'4，日1*，日119，日3*和1117五個(gè)毒力因子人工敲除，發(fā)現(xiàn)該菌株與野生 菌相比，其致病性顯著減弱，但依然能與陽性血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)。
[0042] (2)在兩種活體模型中確定此分離株為強(qiáng)毒力菌株
[0043] A.小鼠半數(shù)致死量
[0044] 如圖3所示，在存活率曲線中，分別將不同的菌株WSXlO6C即/每只劑量通過腹腔 注射的方式感染6周齡Ba化/c小鼠，觀察小鼠的死亡情況。結(jié)果顯示，ZYAH72的致病性顯著 高于傳統(tǒng)嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(W下簡稱為致病標(biāo)準(zhǔn)株）。
[0045] 將不同菌株10倍稀釋后，腹腔注射小鼠，觀察一周內(nèi)小鼠的死亡數(shù)量。根據(jù)Karber 方法計(jì)算不同菌株的LDso值，結(jié)果顯示ZYAH72的LDso值為9.99 X IO5CFU,致病標(biāo)準(zhǔn)株的LDso 為2.75X IO^CFU(表2)。
[0046] 表2ZYAH72和致病標(biāo)準(zhǔn)株對小鼠的LDso
[00471
[004引 B.斑馬魚半數(shù)致死量。
[0049] 將不同菌株5倍稀釋后，腹腔注射體長3-4CM斑馬魚，觀察一周內(nèi)斑馬魚的死亡數(shù) 量。根據(jù)Karber法計(jì)算不同菌株LDso值，其中ZYAH72的LDso值為1.32 X IO4CFU，傳統(tǒng)嗜水氣單 胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(W下簡稱為致病標(biāo)準(zhǔn)株)為8.Ol X IO6CFU(表3)。
[(K)加]表3ZYAH72和致病標(biāo)準(zhǔn)株的LDso
[0化11
[0052]至此，獲得了一株高致病性嗜水氣單胞菌，該細(xì)菌已于該菌株已于2015年12月29 日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，分類命名：嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) ZYAH72，保藏編號:CCTCC NO: M2015797，地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0化3] 實(shí)施例2:
[0化4] 嗜水氣單胞菌ZYAH72的復(fù)蘇及生長曲線：
[0055]嗜水氣單胞菌ZYAH72的培養(yǎng):從-80度冰箱取出保存于甘油中菌種，劃線于TSB固 體培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱中培養(yǎng)2地左右，再挑取平板上單菌落在新鮮TSB固體培養(yǎng)基上 劃線培養(yǎng)，如此傳代復(fù)蘇2次后，從TSB固體培養(yǎng)基中挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中， 然后在28°C，ISOr/min搖床培養(yǎng)，每隔1小時(shí)測定其ODsoonm吸光值，同樣操作作用于致病標(biāo)準(zhǔn) 株，結(jié)果表明ZYAH72和致病標(biāo)準(zhǔn)株均在化左右進(jìn)入對數(shù)期，地~化進(jìn)入平臺期，約含有1〇8 ~10化FU/mL，在進(jìn)入平穩(wěn)期后ZYAH72的吸光值要高于致病標(biāo)準(zhǔn)株，說明本發(fā)明中分離株 ZYAH72生長速率略高于致病標(biāo)準(zhǔn)株(圖4)。
[0化6] 實(shí)施例3:
[0057]嗜水氣單胞菌ZYAH72滅活疫苗的制備：
[005引最佳甲醒濃度的選擇：
[0059] 在培養(yǎng)好的菌液中加入分別終濃度為0.1 %-0.8% (體積分?jǐn)?shù))的甲醒溶液對此強(qiáng) 致病性嗜水氣單胞菌進(jìn)行滅活，28°C搖床中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，將不同滅活疫苗涂布在TSB 固體培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示當(dāng)甲醒濃度為〇.3%-〇.8%時(shí)均能制得完全滅活疫苗，同時(shí)根據(jù)抗 原損失程度結(jié)果表明