一種菌渣培養(yǎng)促中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種菌渣培養(yǎng)促中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法。
技術(shù)背景
[0002]冬蟲(chóng)夏草是冬蟲(chóng)夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上長(zhǎng)出的子座(子實(shí)體)及幼蟲(chóng)蟲(chóng)體的復(fù)合體，屬于可食用的真菌，是我國(guó)一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。
[0003]野生的冬蟲(chóng)夏草僅生長(zhǎng)在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年來(lái)過(guò)度采挖，使得蟲(chóng)草資源已經(jīng)瀕臨滅絕。而另一方面隨著人們生活水平的提高，對(duì)冬蟲(chóng)夏草的需求卻越來(lái)越高，冬蟲(chóng)夏草人工培育成為解決這一問(wèn)題的有效途徑之一。因此，我國(guó)科研人員一直在進(jìn)行利用冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)人工培植冬蟲(chóng)夏草來(lái)替代野生冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)業(yè)化研究。冬蟲(chóng)夏草要完成產(chǎn)業(yè)化，首先必須找到它正確的菌種，然后利用冬蟲(chóng)夏草菌來(lái)侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，進(jìn)而培植出冬蟲(chóng)夏草。經(jīng)過(guò)多年的研究，冬蟲(chóng)夏草菌被鑒定為中國(guó)被毛孢，又稱為蝙蝠蛾被毛孢。
[0004]人工培植冬蟲(chóng)夏草主要是采用中國(guó)被毛孢的菌絲體來(lái)侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，但是這種常規(guī)侵染方法的侵染率不高，使得培植冬蟲(chóng)夏草的成功率受到影響，阻礙了冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。隨著對(duì)人工培植冬蟲(chóng)夏草技術(shù)領(lǐng)域的不斷探索，有研究表明采用中國(guó)被毛孢的分生孢子來(lái)侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)能夠明顯提高侵染率。因此，人工制備中國(guó)被毛孢菌分生孢子的過(guò)程就成為影響人工培植冬蟲(chóng)夏草成功率的重要環(huán)節(jié)。
[0005]目前，有關(guān)中國(guó)被毛孢產(chǎn)生分生孢子的報(bào)道較少，且分生孢子的數(shù)量不高。如文獻(xiàn)“不同因子對(duì)冬蟲(chóng)夏草真菌產(chǎn)生分生孢子的研究”(李玉玲，《食用菌》2002年第5期)，其論述了中國(guó)被毛孢在不同培養(yǎng)基、不同光照以及不同溫度下產(chǎn)生分生孢子的研究;又如文獻(xiàn)“不同微量元素和生長(zhǎng)因子對(duì)冬蟲(chóng)夏草分生孢子產(chǎn)量的影響”(李玲玲，羅合春，胡敏，《重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)》2014年第2期)，其通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)及配方中添加微量元素和氨基酸生長(zhǎng)因子，研究了不同微量元素和生長(zhǎng)因子對(duì)中國(guó)被毛孢孢子產(chǎn)量的影響，但是利用上述文獻(xiàn)中的方法所得到的分生孢子數(shù)量不高于15數(shù)量級(jí)。因此，如何通過(guò)培養(yǎng)獲得大量分生孢子，已逐漸成為人工培植冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過(guò)程中的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種菌渣培養(yǎng)促中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，在分生孢子誘導(dǎo)階段選用一定種類(lèi)的光源進(jìn)行光周期刺激培養(yǎng)，該方法獲得分生孢子的周期短且產(chǎn)量高。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種菌渣培養(yǎng)促中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，包括以下制備步驟:
[0008](I)菌種選擇:收集冬蟲(chóng)夏草子囊孢子，挑取單子囊孢子進(jìn)行培養(yǎng)，得到中國(guó)被毛孢單子囊孢子菌落；
[0009](2)菌渣獲得:在菌落中挑取3-5塊菌塊接種于培養(yǎng)基中，將菌塊打碎，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10天，記為一級(jí)搖瓶;將一級(jí)搖瓶進(jìn)行擴(kuò)培，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，記為二級(jí)搖瓶;將二級(jí)搖瓶進(jìn)行擴(kuò)培，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，記為三級(jí)搖瓶;將獲得的三級(jí)搖瓶進(jìn)行菌液分離，獲得的菌絲體即為菌渣；
[0010](3)菌渣生長(zhǎng):將菌渣分裝于無(wú)菌廣口瓶中，底部墊上吸水棉，封好瓶蓋，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長(zhǎng)；
[0011 ] (4)分生孢子誘導(dǎo):待菌渣表面布滿氣生菌絲后，在一定溫濕度下光周期刺激培養(yǎng)進(jìn)行分生孢子誘導(dǎo)，誘導(dǎo)一定時(shí)間后得到大量散落的分生孢子；
[0012]所述光周期刺激培養(yǎng)為光照培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí);其中，光照的光源選自藍(lán)光、紅光、或藍(lán)光與紅光的組合。
[0013]分生孢子是微生物對(duì)于特定條件下的一種應(yīng)急反應(yīng)，可以理解為不利環(huán)境下，微生物為了不使自身的種屬被滅絕而產(chǎn)生的一種更為穩(wěn)定、耐受性更強(qiáng)的無(wú)性繁殖體，因此特定的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件相互協(xié)調(diào)才能制備得到大量的分生孢子。申請(qǐng)人在對(duì)中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)深入研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)，提供了一種菌渣培養(yǎng)促中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，本發(fā)明所述方法分為菌種選擇、菌渣獲得、菌渣生長(zhǎng)和分生孢子誘導(dǎo)四個(gè)階段。
[0014]本發(fā)明中選用冬蟲(chóng)夏草單子囊孢子作為菌種，相對(duì)于其他組織分離的菌種具有穩(wěn)定性好、活力強(qiáng)、特別是發(fā)酵出來(lái)的菌絲體量多的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)菌絲多級(jí)擴(kuò)培，能夠極大的提高分生孢子的數(shù)量。
[0015]本發(fā)明中所述菌渣獲得階段，在一些實(shí)施方式中，所述搖瓶培養(yǎng)基的配方，由以下質(zhì)量百分比的組分組成:蠶蛹粉0.5%，蛋白胨0.5-1.5%，酵母粉1-2%;葡萄糖2-4%，無(wú)水硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鋅0.0013%，天門(mén)冬氨酸0.1%，維生素C0.1%，純牛奶8%。
[0016]本發(fā)明中所述菌渣獲得階段，在一些實(shí)施方式中，菌塊打碎后在搖床中的培養(yǎng)條件為:在120rpm下，20 °C恒溫培養(yǎng)。
[0017]本發(fā)明中所述菌渣生長(zhǎng)階段的溫度控制在15_20°C;在一些實(shí)施方式中，所述菌渣生長(zhǎng)階段的溫度為15°C ;在另一些實(shí)施方式中，所述菌渣生長(zhǎng)階段的溫度為18°C ;在又一些實(shí)施方式中，所述菌渣生長(zhǎng)階段的溫度為20°C。同時(shí)，所述菌渣生長(zhǎng)階段的濕度控制在60-80%，所述菌渣的生長(zhǎng)時(shí)間控制在15-25天，優(yōu)選為20天。
[0018]在所述分生孢子誘導(dǎo)階段，申請(qǐng)人重點(diǎn)對(duì)溫度和光源的選擇進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，低溫有助于刺激分生孢子的產(chǎn)生，優(yōu)選地，誘導(dǎo)分生孢子的溫度控制在5-10°C;在一些實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)分生孢子的溫度為5°C ;在另一些實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)分生孢子的溫度為8°C;在又一些實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)分生孢子的溫度為10°C。同時(shí)，所述誘導(dǎo)分生孢子的濕度控制在70-90%。進(jìn)行光照周期刺激培養(yǎng)時(shí)，光源種類(lèi)的選擇對(duì)分生孢子的誘導(dǎo)時(shí)間有重要影響。相同培養(yǎng)條件下，選擇一定的光源，調(diào)整誘導(dǎo)時(shí)間，可獲得最大數(shù)量的分生孢子。在一些實(shí)施方式中，所述光源為藍(lán)光，誘導(dǎo)時(shí)間為20天;在另一些實(shí)施方式中，所述光源為紅光，誘導(dǎo)時(shí)間為20天;在又一些實(shí)施方式中，所述光源為藍(lán)光與紅光的組合，誘導(dǎo)時(shí)間為15天;在又一些實(shí)施方式中，所述光源為藍(lán)光與紅光的組合，誘導(dǎo)時(shí)間為10天。
[0019]除非明確說(shuō)明，否則，本發(fā)明引用的所有范圍包括端值，例如，“溫度為15-20°C”，表示溫度范圍為15°C <T<20°C。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于:
[0021](I)本發(fā)明中選用從新鮮冬蟲(chóng)夏草中分離的單子囊孢子作為菌種，相對(duì)于其他組織分離的菌種具有穩(wěn)定性好、活力強(qiáng)、特別是發(fā)酵出來(lái)的菌絲體量多的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)菌絲多級(jí)擴(kuò)培，能夠極大的提高分生孢子的數(shù)量。
[0022](2)通過(guò)對(duì)光源進(jìn)行選擇，可以在提高分生孢子數(shù)量的基礎(chǔ)上，縮短分生孢子的誘導(dǎo)時(shí)間，使中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的周期更短。
[0023](3)本發(fā)明提供的菌渣培養(yǎng)促中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，周期短，產(chǎn)量高，對(duì)人工培植冬蟲(chóng)夏草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明中菌渣生長(zhǎng)階段布滿氣生菌絲的圖片。
[0025]圖2為實(shí)施例3制備的大量中國(guó)被毛孢腎形分生孢子的鏡檢圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下所述的是本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明所保護(hù)的不限于以下【具體實(shí)施方式】。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在此發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的基礎(chǔ)上，做出的若干變形和改進(jìn)，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所用的原料如無(wú)特殊說(shuō)明，均可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得。
[0027]實(shí)施例1
[0028]培養(yǎng)基配方(質(zhì)量百分比):蠶蛹粉0.5%，蛋白胨1%，酵母粉2%，葡萄糖2%，無(wú)水硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鋅0.0013%，天門(mén)冬氨酸0.1%，維生素C0.1%，純牛奶8%。
[0029]收集野生新鮮冬蟲(chóng)夏草子囊孢子，通過(guò)體視鏡挑取單子囊孢子進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)之后獲得中國(guó)被毛孢單子囊孢子菌落試管斜面;選取長(zhǎng)勢(shì)良好的中國(guó)被毛孢單子囊孢子菌落試管斜面，并挑取數(shù)塊0.5cm2左右大小的菌塊接種于能獲得大量菌絲體的培養(yǎng)基中，用無(wú)菌勾楽器將菌塊均勾打碎，于120rpm，20°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10天，記為一級(jí)搖瓶，將一級(jí)搖瓶進(jìn)行擴(kuò)培，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，記為二級(jí)搖瓶，以此類(lèi)推，將獲得的三級(jí)搖瓶在潔凈區(qū)進(jìn)行菌液分離，獲得的菌絲體即為菌渣;將菌渣分裝于500ml無(wú)菌廣口瓶中，底部墊上吸水棉，裝量約為廣口瓶體積的二分之一，用紗布以及封口膜封好瓶蓋，放置于溫度為15°C、濕度為60%的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng);25天后，菌渣表面完全生長(zhǎng)透徹，布滿氣生菌絲，再在溫度為8°C、濕度為80%的條件下，紅光培養(yǎng)12小時(shí)，黑暗培養(yǎng)12小時(shí)，誘導(dǎo)分生孢子，誘導(dǎo)20天后即可得到大量散落的中國(guó)被毛孢腎形分生孢子。
[0030]經(jīng)無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基斜面得到懸浮液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)懸浮液進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和鏡檢，鏡檢可明顯看到大量散落的中國(guó)被毛孢菌種腎形分生孢子，統(tǒng)計(jì)結(jié)果中分生孢子總數(shù)為111數(shù)量級(jí)。
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