一種人肺腺癌細(xì)胞株ha109及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種新的人肺腺癌細(xì)胞株HAl 09及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]體外建立肺癌細(xì)胞系為研究腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究提供了極其重要的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀５请S著實(shí)驗(yàn)的不斷開(kāi)展，常需要對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行不斷的體外傳代，于是一些生物學(xué)特征會(huì)漸漸的改變或消失，所以不斷建立新的細(xì)胞系已經(jīng)成為研究肺癌的發(fā)病機(jī)理和探尋新的治療方法的重要環(huán)節(jié)。
[0003]原代細(xì)胞的培養(yǎng)難易程度與取材時(shí)的組織類(lèi)型、分化程度、年齡等密切相關(guān)，一般來(lái)講，胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長(zhǎng)，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)大多采用手術(shù)中切除的早中期病人腫瘤組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，包括直接將組織進(jìn)行消化培養(yǎng)或是將病人腫瘤組織移植至小鼠體內(nèi)，待成瘤后，再取出小鼠腫瘤組織進(jìn)行消化培養(yǎng)。
[0005]胸水細(xì)胞的主要成分為淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、少量脫落的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等，成分相對(duì)較為復(fù)雜，胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞屬于高分化的成熟細(xì)胞，比較脆弱，一般而言比較難培養(yǎng)。但是相對(duì)于原發(fā)腫瘤灶，胸水取材容易，如果能建立穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，對(duì)肺癌原代細(xì)胞的建立有很大的推廣意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的人肺腺癌細(xì)胞株HAl 09及其建立方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0008]—種人肺腺癌細(xì)胞株HA109的建立方法，包括以下步驟:
[0009](I)、去除中晚期肺癌病人胸腔積液中的血塊，離心后得到上清液和沉淀；
[0010](2)、將步驟(I)的沉淀用兩倍體積的PBS重懸，再按1:1的體積比緩慢貼壁加入到人外周血淋巴分離液的液面上，離心；
[0011 ] (3)、小心吸取分離液面交界處的液體，得到腫瘤細(xì)胞和部分上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，無(wú)菌PBS清洗，離心棄上清；
[0012](4)、使用含0.5?2wt%的青-鏈雙抗的步驟(I)的上清液作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(3)的細(xì)胞；
[0013](5)、待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，用0.25?0.5wt%的胰酶消化，離心后，用PBS將沉淀重懸成細(xì)胞懸液;所述PBS與沉淀的體積比為2?3:1;
[0014](6)、預(yù)先在干凈離心管中依次緩慢貼壁加入40%的比重為1.056的percoll液和20%的比重為1.031的口6代011液；
[0015](7)、將步驟(5)的細(xì)胞懸液緩慢貼壁加入到步驟(6)的離心管中，離心；
[0016](8)、吸取40 %的per CO 11液面處的液體，無(wú)菌PBS清洗，離心棄上清，得到腫瘤細(xì)胞，使用步驟(4)中的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0017](9)、重復(fù)步驟(4)-(8)—次，然后進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代時(shí)，步驟(4)的條件培養(yǎng)基的上清液的比例每次減少20%，再相應(yīng)增加20%含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，到第五代時(shí)條件培養(yǎng)基為加青-鏈雙抗的10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；
[0018](10)、將傳代五次后的細(xì)胞注射小鼠成瘤，殺小鼠取腫瘤并消化，得到原代人肺腺癌細(xì)胞株HAl 09。
[0019]在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)所述人外周血淋巴分離液的比重為1.077。
[0020]在其中一些實(shí)施例中，步驟(I)所述離心是在4°C 1000rpm/min離心lOmin;步驟(2)所述離心是在20 °C 1350rpm/min升速5，降速O，水平離心25分鐘；步驟(7)所述離心是在20°C2000rpm/min，升速5，降速O，水平離心25分鐘。
[0021]在其中一些實(shí)施例中，步驟(4)的青-鏈雙抗的含量為lwt%
[0022]在其中一些實(shí)施例中，步驟(4)中置于37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0023]在其中一些實(shí)施例中，步驟(5)中所述PBS與沉淀的體積比為2:1。
[0024]本發(fā)明還提供了上述建立方法建立的人肺腺癌細(xì)胞株HA109。
[0025]本發(fā)明創(chuàng)建了一種從中晚期病人的癌性胸腔積液中分離純化腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并建系的方法。分離得到活力高的腫瘤細(xì)胞后，用胸腔積液加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每次傳代，利用上皮和內(nèi)皮細(xì)胞容易脫落，而腫瘤細(xì)胞貼壁更牢固的特點(diǎn)，丟棄先脫落的細(xì)胞，剩下腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，逐步剔除內(nèi)皮和上皮細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)以下幾個(gè)特殊的處理實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的發(fā)明目的:
[0026]1、本發(fā)明的人肺腺癌細(xì)胞株HA109的建立方法中分離腫瘤細(xì)胞時(shí)采用了兩次雙密度梯度離心法，第一次雙密度梯度離心法，得到含量較高的腫瘤細(xì)胞和部分成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，由于成纖維細(xì)胞通常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)更快，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制甚至死亡，因此本發(fā)明利用反復(fù)貼壁法剔除成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，再次采用雙密度梯度離心法，分離除去凋亡和死亡細(xì)胞，得到活力高的腫瘤細(xì)胞；
[0027]2、由于成熟腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境變化劇烈，細(xì)胞不容易適應(yīng)，容易造成生長(zhǎng)緩慢甚至死亡，因此本發(fā)明采用了在培養(yǎng)初期，用自體胸腔積液加二抗為主的條件培養(yǎng)基，使細(xì)胞適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，視長(zhǎng)出的細(xì)胞量適當(dāng)加大含10%胎牛血清的DMEM量，逐步過(guò)渡到細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)不加胸腔積液上清；
[0028]3、為了得到活力高的腫瘤細(xì)胞，本發(fā)明將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞接種至裸鼠中，通過(guò)裸鼠體內(nèi)的自然篩選，那些生長(zhǎng)能力較強(qiáng)的細(xì)胞群體(腫瘤細(xì)胞)繼續(xù)生長(zhǎng)存活，相對(duì)生長(zhǎng)能力較弱的群體(包括人成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞)就會(huì)慢慢丟失，再將裸鼠體內(nèi)的移植瘤取出作原代細(xì)胞培養(yǎng)，從而得到本發(fā)明所需要的高活力的原代人肺腺癌細(xì)胞。
[0029]本發(fā)明所述的人肺腺癌細(xì)胞株HA109已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)，武漢，武漢大學(xué))保藏，保藏日期為2016年I月28日，保藏編號(hào)為CCTCCNo:C201617。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
[0031]由于中晚期肺癌病人的組織標(biāo)本一般難以獲得，成熟的高分化腫瘤細(xì)胞較難體外培養(yǎng)，本發(fā)明從比較容易獲得又不為病人帶來(lái)痛苦的胸腔積液中分離純化高分化的腫瘤細(xì)胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更簡(jiǎn)單方便且成功率大大提高。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為160X光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞稀疏與密集生長(zhǎng)的狀態(tài)圖；
[0033]圖2分別為12000X和25000X透射電鏡下的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖，其中2-1中，A為核仁，B為細(xì)胞表面微絨毛，C為細(xì)胞核;2-2中，六為線(xiàn)粒體;B為內(nèi)漿網(wǎng)，C為自噬體；
[0034]圖3分別為1.2K X掃描電鏡下的細(xì)胞生長(zhǎng)情況圖和5.0K X掃描電鏡下的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)圖；
[0035]圖4為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果圖；
[0036]圖5為染色體核型分析結(jié)果；
[0037]圖6為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖；
[0038]圖7分別為克隆形成圖和克隆形成率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，所采用的技術(shù)手段通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0040]本發(fā)明的人肺腺癌細(xì)胞株HA109的建立方法的主要流程為:
[0041 ]胸腔積液—人外周血淋巴分離液—得到腫瘤細(xì)胞和部分上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞用胸腔積液加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)—雙密度梯度離心得到活力高的腫瘤細(xì)胞—反復(fù)貼壁法—剔除內(nèi)皮及上皮細(xì)胞—逐步減少胸腔積液比例—直接用含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)—培養(yǎng)細(xì)胞注射小鼠成瘤—?dú)⑿∈笕∧[瘤并消化—活力好的原代腫瘤細(xì)胞。
[0042]實(shí)施例1人肺腺癌細(xì)胞株HA109的建立方法
[0043]包括以下具體步驟:
[0044](I)、將中晚期肺癌病人的胸腔積液過(guò)IΟΟμπι濾網(wǎng)除去血塊，40C1000rpm/min離心I Omin得到上清液和沉淀，將上清液吸出另外保存；
[0045](2)、在離心管中準(zhǔn)備人外周血淋巴分離液(LTS1077，天津?yàn)?，比重?.077)，將步驟I的沉淀用兩倍體積的PBS重懸，再按PBS重懸液與人外周血淋巴分離液的體積比1:1，將PBS重懸液緩慢貼壁加入人外周血淋巴分離液