用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病，世界衛(wèi)生組織估計(jì)2008年全球有760萬癌癥病人死亡，中國有196萬人，占全球癌癥死亡人數(shù)的25.89%。全國第3次死因回顧抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，隨著我國衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高，某些疾病如急性傳染病、母嬰疾病等已得到了明顯有效的控制，惡性腫瘤死亡率則呈明顯上升趨勢，已經(jīng)成為影響我國居民健康的主要的死亡原因之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)專家預(yù)測，2020年全球人口 80億，癌癥新發(fā)病例將達(dá)到2000萬，1200萬人死于癌癥，癌癥將成為新世紀(jì)人類的第一殺手，并成為全球最大的公共衛(wèi)生問題之一。因此，采取有效的手段研究和開發(fā)抗腫瘤藥物就顯得極其重要了。
[0003]目前，對(duì)于多數(shù)患相同疾病的不同病人，治療方法是用同樣的藥、標(biāo)準(zhǔn)的劑量，但實(shí)際上不同病人在治療效果、不良反應(yīng)方面有很大的差異，有時(shí)候這種差異甚至是致命的，個(gè)體化化療是根據(jù)癌癥患者藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)特點(diǎn)，采用特異和最佳的化療藥物方案進(jìn)行化療的方法，個(gè)體化化療可以幫助患者選擇合適的化療藥物，提高治療的針對(duì)性，最大程度的延長患者的生存期。因此，在醫(yī)院醫(yī)生指導(dǎo)腫瘤病人用藥時(shí)，必須根據(jù)不同的人不同的腫瘤選用不同的藥物，即使是同一腫瘤，不同的患者也對(duì)藥物的敏感性存在較大差異。因此，醫(yī)生需要一個(gè)能夠高效、快捷地篩選出適合特定病人的抗腫瘤藥物?，F(xiàn)有的二維細(xì)胞養(yǎng)基質(zhì)與動(dòng)物體內(nèi)存在巨大差異，易造成藥物假陽性，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期長，成本高昂，應(yīng)用性不廣。因此需要建立適用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的簡便快捷高效成本低的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的使用。
[0004]基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)模型是目前細(xì)胞三維培養(yǎng)模型之一，所謂基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)是指在細(xì)胞培養(yǎng)器的底部覆蓋一層膠原形成基底膠，使細(xì)胞在基底膠中生長，分化，形成三維結(jié)構(gòu)，基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)模型的實(shí)質(zhì)是模擬細(xì)胞生長的外環(huán)境(ECM)，使細(xì)胞生長在與體內(nèi)相似微環(huán)境中，體內(nèi)細(xì)胞生長在被ECM圍繞的三維細(xì)胞中，其它的細(xì)胞浸潤在血清和組織液中，血清和中含有可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞繁殖的因子，并且可將組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)從正常的分化功能轉(zhuǎn)移成典型的傷口治療反應(yīng)。該方法適合在普通實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，具有廣泛的應(yīng)用性，然而，現(xiàn)有的細(xì)胞三維培養(yǎng)基質(zhì)采用Matrigel基質(zhì)膠作為細(xì)胞培養(yǎng)材料，機(jī)械性能較差，且價(jià)格昂貴造成實(shí)驗(yàn)成本居高不下不利于三維培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)異種移植，限制了細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種機(jī)械性能好，能促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的形成且同時(shí)通過藥效一致性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，藥敏性接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平、成本適宜的用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料的制備方法。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的:
[0008]用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料，所述用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分= Matrigel基質(zhì)膠5%-25%、低粘度藻朊酸鈉溶液31%-55 %和透明質(zhì)酸鈉溶液9 % -27 %。
[0009]進(jìn)一步地，所述用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料還包括8%_25%中粘度藻朊酸鈉溶液，所述中粘度藻朊酸鈉溶液為中藻朊酸鈉為2% (w/v)，所述低粘度藻朊酸鈉溶液中藻朊酸鈉為4% (w/v)，所述透明質(zhì)酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為10mg/ml。
[0010]進(jìn)一步地，所述用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:Matrigel基質(zhì)膠15%，低粘度藻朊酸鈉溶液40%，中粘度藻朊酸鈉溶液10%，透明質(zhì)酸鈉溶液為12 %。
[0011]用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)制備藻朊酸鈉混合液，將2%中粘度藻朊酸鈉溶液和4%低粘度的藻朊酸鈉溶液按一定體積比混合形成藻朊酸鈉混合液，由此可以改善藻朊酸鈉凝膠的性能，為體外細(xì)胞生長提供支架。
[0013](2)除去藻朊酸鈉混合液中氣泡，將步驟(I)中制得的藻朊酸鈉混合液置于冰上10-20min以消除汽泡以防止包裹細(xì)胞時(shí)氣泡破裂造成細(xì)胞損傷。
[OOM] (3)將10mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液和經(jīng)過4°C過夜溶解的Matrigel基質(zhì)膠溶液按一定體積比混合，用無菌吸管上下吹打3-5次使之均勾混合，置于冰上5-10min，防止Matrigel在室溫下形成凝膠。
[0015](4)將步驟(3)制得的混合溶液與步驟(2)中的藻朊酸鈉混合液混合均勻，并置于冰上10-15min，消除氣泡，否則在對(duì)腫瘤細(xì)胞組織塊進(jìn)行包裹時(shí)，鈣離子與制備的混合溶液螯合形成的藻朊酸鈉凝膠小珠會(huì)有大量氣泡，一旦小珠的氣泡破裂，容易造成小珠崩解。
[0016]進(jìn)一步地，所述步驟(I)中2%中粘度藻朊酸鈉溶液和4%低粘度的藻朊酸鈉溶液的混合體積比為1:1-1:5。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中10mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液和Matrigel基質(zhì)膠溶液的混合體積比為I:2~1:6。
[0018]進(jìn)一步地，還包括對(duì)所述2 %藻朊酸鹽溶液的配制，配制步驟為稱取Ig藻朊酸鈉粉末邊攪拌邊緩慢加入50°C水浴加熱的蒸餾水中，高壓蒸汽加熱，自然冷卻至室溫再用0.22μm濾器過濾。
[00?9] 進(jìn)一步地，所述10mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液通過以下步驟制備，稱取200mg透明質(zhì)酸鈉粉末加入到20ml PH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中，過夜靜置后，用0.22μπι濾器過濾制得。
[0020]本發(fā)明提供的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0021](I)采用透明質(zhì)酸鈉和藻朊酸鈉生物相容性好，對(duì)細(xì)胞無毒副作用，對(duì)人和環(huán)境友好，并且價(jià)格較低，大大降低了三維細(xì)胞培養(yǎng)的成本。同時(shí)，將不同粘度的藻朊酸鈉溶液以適當(dāng)?shù)谋壤?lián)合使用，改變了藻朊酸鈉與CaC12溶液發(fā)生螯合反應(yīng)形成的乳白色小珠的微觀分子結(jié)構(gòu)，大大改善了乳白色小珠的機(jī)械性能。
[0022](2)采用Matrigel、透明質(zhì)酸鈉和藻朊酸鈉以適當(dāng)?shù)谋壤浔人纬傻娜S細(xì)胞培養(yǎng)材料，達(dá)到良好的細(xì)胞三維培養(yǎng)效果，適合多種腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)，應(yīng)用范圍廣。
[0023](3)本發(fā)明所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料制備簡單，成本較為低廉，重復(fù)性好，易于在實(shí)驗(yàn)室推廣。
[0024](4)在本發(fā)明中，三維細(xì)胞培養(yǎng)材料可用于腫瘤個(gè)體化醫(yī)療快速篩選抗腫瘤藥物，腫瘤病人術(shù)后的腫瘤組織或手術(shù)腫瘤穿刺得到腫瘤細(xì)胞可直接用本發(fā)明提供的三維培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)，檢測抗腫瘤藥物藥敏性，所篩選的抗腫瘤藥物有更強(qiáng)的個(gè)體特異性，臨床應(yīng)用簡便快捷。
【附圖說明】
[0025]圖1腫瘤細(xì)胞分別在二維常規(guī)培養(yǎng)和實(shí)施例1制備的三維培養(yǎng)材料培養(yǎng)下腫瘤惡性表型相關(guān)生長因子(如炎癥因子IL-8和血管內(nèi)皮生長因子VEGF)表達(dá)對(duì)比圖(圖1a中腫瘤細(xì)胞為前列腺癌PC3細(xì)胞;圖1b中腫瘤細(xì)胞為DU145細(xì)胞)；
[0026]圖2腫瘤細(xì)胞分別在二維常規(guī)培養(yǎng)和實(shí)施例1制備的三維培養(yǎng)材料培養(yǎng)下EMT(Epithelial mesenchymal transit 1n)過程相關(guān)生物標(biāo)記物(MMP-2，MMP_3，MMP_9)表達(dá)對(duì)比圖(圖2a中腫瘤細(xì)胞為前列腺癌PC3細(xì)胞，圖2b中腫瘤細(xì)胞為DUl 45細(xì)胞)；
[0027]圖3熒光素酶法測定基于三種培養(yǎng)基(二維(2D)常規(guī)培養(yǎng)、Matrigel基質(zhì)的3D培養(yǎng)、實(shí)施例1制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料(3D mixture Matrix))培養(yǎng)的PC3細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)腫瘤(in vivo)PC3細(xì)胞分別經(jīng)過藥物(鹽酸阿霉素、紫杉醇和阿糖胞苷)作用后四者的caspase-3含量(熒光強(qiáng)度)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0029]在三維細(xì)胞培養(yǎng)材料中，添加一定的Matrigel，可為體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)提供相關(guān)的生長因子和蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、迀移和和分化，有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞形成三維結(jié)構(gòu);透明質(zhì)酸鈉是一種酸性粘多糖，具有調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等功能，在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，加入合適含量的透明質(zhì)酸鈉，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和粘附，加快腫瘤細(xì)胞球體形成;藻朊酸鈉是一種天然多糖，具有良好的凝膠性和成膜性，藻朊酸鈉溶液和氯化鈣溶液中的鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)形成機(jī)械性能好