一種二醇脫水酶基因pduCDE的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種二醇脫水酶基因Pdu⑶E的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]二醇脫水酶(D1l dehydratase , EC 4.2.1.28)和甘油脫水酶(Glycero Idehydratase,EC 4.2.1.30)是同功酶，它們能以甘油、I，2_丙二醇或I，2_乙二醇為底物，分別轉(zhuǎn)化生成重要的化工原料3-羥基丙醛、丙醛或乙醛，最值得關(guān)注的是，該酶是催化甘油脫水生成重要的中間產(chǎn)物3-羥基丙醛的限速酶和關(guān)鍵酶(Lee H.A.J.R.and Abeles R.H.，1963，Purificat1n and properties of d1ldehydrase,and enzyme requiring acobamide coenzyme, J.B1l.Chem.，238:2367-2373)。由于3-輕基丙酸可作為食物防腐的抗菌劑，而且還是丙烯醛、丙烯酸、3-羥基丙酸以及I，3_丙二醇等多種重要化工原料的合成前體(如圖1所示)，因此，和甘油脫水酶一樣，二醇脫水酶由于能將甘油催化脫水生成3-羥基丙醛而在生物化工界中占有重要的地位(Slininger P.J.，Bothast R.J.，1983，SmileyK.L.Product 1n of3-hydroxyprop1naldehyde from glycerol，Appl EnvironMicrob1l，46(l):62-67.)0
[0003]近年來，由于石油資源和生產(chǎn)能源的日益枯竭，通過化學合成法制備丙烯醛、丙烯酸、3-羥基丙酸以及I，3_丙二醇等這類重要的化工原料已無競爭優(yōu)勢。生物法制備3-羥基丙醛，是通過脫水酶的催化作用，直接將甘油脫水形成的產(chǎn)物3-羥基丙醛;3-羥基丙醛作為重要的中間產(chǎn)物，再通過其它反應(yīng)轉(zhuǎn)化成丙烯醛、丙烯酸、3-羥基丙酸以及I，3_丙二醇(Vollenweider S.,Lacroix C.,2004,3-Hydroxyprop1naldehyde applicat1ns andperspectives of b1technological product1n，Appl Microb1l B1technol,64(I):16-27.);生物法制備I，3-丙二醇，是通過I，3-丙二醇氧化還原酶的還原作用，將上述的中間產(chǎn)物3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成I，3-丙二醇；生物法制備3-羥基丙酸，而是在乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,AldH,EC 1.2.1.5)的氧化作用下，將3_輕基丙醛轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物3_輕基丙酸(Mohan Raj S.,Rathnasingh C.，Jung W.C.,et al.2009,Effect of processparameters on 3-hydroxyprop1nic acid product1n from glycerol using arecombinant Escherichia col1.Appl Microb1l B1technol，84(4):649-657.)。
[0004]生物發(fā)酵法(酶法)制備上述化工原料，是通過微生物發(fā)酵可再生的生物原料為出發(fā)點，具有多種優(yōu)勢而成為研究重點。特別是隨著3-羥基丙酸和I，3_丙二醇需求量的急劇增加，二醇脫水酶和甘油脫水酶在生物催化甘油生成重要的化工原料進程中起到無可替代的作用，而引起了生化工業(yè)界足夠的重視，并成為研究熱點。
[0005]目前，國內(nèi)外對二醇脫水酶的研究主要集中在一些腸桿菌中，如克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae )、沙門氏菌(Salmone I la enter i ca)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和乳酸桿菌屬(LactobaciIIus d1Ivorans和LactobaciIIusbrevis)等，由于它們可能存在的致病性或嚴格的培養(yǎng)條件，限制了這些天然菌發(fā)酵甘油制備上述化工原料的應(yīng)用，所以從這些天然菌中克隆相關(guān)基因以構(gòu)建高效的基因工程菌逐漸成為研究重點。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)，二醇脫水酶和甘油脫水酶理化性質(zhì)的差異除了對底物的親和力不同以夕卜，他們一個明顯的差異是在于其表達的可溶性，甘油脫水酶的可溶性好，而二醇脫水酶的可溶性較差，特別是乳桿屬的丘狀乳桿菌(Lactobaci I Ius col Iinoides)和Lactobaci I Iusd1lvorans 二醇脫水酶基因表達產(chǎn)物的可溶性更差，可溶性問題嚴重制約了這類二醇脫水酶的研究和應(yīng)用(Tobimatsu T.,Nishiki T.,Morimoto M.，et al.2009,Low-solubilityglycerol dehydratase，a chimeric enzyme of coenzyme Bi2~dependent glycerol andd1l dehydratases.Arch Microb1l，191(3):199-206.)。
[0007]2002年Nicolas S.等人對丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides)的二醇脫水酶相關(guān)操縱子進行了詳細的研究并遞交了基因序列(Nicolas S.,Muller C.,Hartke A.，et al.2002，Characterisat1n of the d1l dehydratase pdu operon ofLactobacillus collinoides.FEMS Microb1logy Letters，209( I):66?71.)。盡管他們研究小組對該天然菌中的二醇脫水酶進行分離純化與酶學性質(zhì)研究，然而，當從該菌株克隆的二醇脫水酶基因在大腸桿菌中進行表達時，無論應(yīng)用什么表達條件和方法，都沒有檢測該酶的活力，可能是發(fā)酵條件的限制或是大腸桿菌缺少一些修飾系統(tǒng)，使某些外源蛋白沒有得到正確的折疊，從而嚴重限制了該脫水酶進一步研究和應(yīng)用(Nicolas S，VianneyP,LoIc L,et.al.2002.Purificat1n,characterizat1n and subunits identificat1nof the d1l dehydratase of Lactobacillus collinoides.Eur.J.B1chem.269:5731~5737.)o
[0008]到目前為止，沒有檢索到任何有關(guān)丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides)二醇脫水酶基因在大腸桿菌中成功克隆表達和應(yīng)用的論文和專利，也沒有檢索到應(yīng)用該重組酶轉(zhuǎn)化甘油制備3-羥基丙醛、I，3_丙二醇和3-羥基丙酸的相關(guān)文獻。
[0009]本發(fā)明專利運用現(xiàn)代基因工程技術(shù)和特殊的發(fā)酵條件，首次實現(xiàn)了丘狀乳桿菌(Lactobacillus col lino ides) 二醇脫水酶在大腸桿菌的高效而可溶地表達，并顯示良好的二醇脫水酶活力，該基因編碼的二醇脫水酶能夠?qū)⒏视痛呋?-羥基丙醛。在此發(fā)明基礎(chǔ)上，可進一步分別把I，3_丙二醇氧化還原酶或乙醛脫氫酶等相關(guān)基因一起重組到大腸桿菌中得到新的重組工程菌，工程菌可以通過發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化為I，3_丙二醇或3-羥基丙酸，首次挖掘了丘狀乳桿菌(LactobaciIIus colIinoides)二醇脫水酶基因工程菌發(fā)酵甘油的能力，并展現(xiàn)了其良好工業(yè)應(yīng)用的前景，顯示了技術(shù)上的先進性和獨創(chuàng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的是提供一種二醇脫水酶基因PduCDE在含有該基因的工程菌在發(fā)酵甘油制備3-羥基丙醛、I，3-丙二醇和3-羥基丙酸過程中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明所述的一種二醇脫水酶基因pduCDE，是通過提取丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides，LMG 18850)基因組DNA，根據(jù)GenBank中已報道的基因序列為依據(jù)設(shè)計引物，經(jīng)過PCR方法擴增得到的二醇脫酶基因pduCDE。在合適的發(fā)酵條件下，該基因能在大腸桿菌中實現(xiàn)高效而可溶地表達，并顯示出良好二醇脫水酶活力，由該基因構(gòu)建的重組大腸桿菌能夠?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化生成3-羥基丙醛。
[0012]在此發(fā)明基礎(chǔ)上，把1，3-丙二醇氧化還原酶基因yqhD和該二醇脫水酶基因pduCDE一起重組到大腸桿菌中進行共表達，得到的重組工程菌可以通過發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化為I，3_丙二醇。
[0013]在此發(fā)明基礎(chǔ)上，當把乙醛脫氫酶基因aldH和該二醇脫水酶基因pduCDE—起重組到大腸桿菌中進行共表達，得到新的工程菌可以通過發(fā)酵將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸。
[0014]丘狀乳桿菌二醇脫水酶基因pdu⑶E在大腸桿菌中的成功表達和應(yīng)用，促進了生物轉(zhuǎn)化甘油制備3-羥基丙醛、I，3_丙二醇和3-羥基丙酸等的新工藝的誕生。
[0015]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下:
[0016]本發(fā)明所述二醇脫水酶基因pduCDE是根據(jù)GenBank已公布的丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides，LMG 18850)的二醇脫水酶基因序列(GenBank Access1nN0.AJ297723.3)為依據(jù)，設(shè)計一對引物，通過PCR的方法，從丘狀乳桿菌基因組上得到的；將pduCDE基因與表達載體pET-22b( + )連接構(gòu)建成表達質(zhì)粒pET-22b-pduCDE，其表達產(chǎn)物為二醇脫水酶Pdu⑶E，其重組大腸桿菌用于發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛。