一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及稀有人參皂苷20(S)-Rg3的制備方法，尤其涉及利用重組表達(dá)的來源于Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶和Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl、Rb2、Rc生成20(S)-Rg3。
【背景技術(shù)】
[0002]人參Panaxginseng是亞洲傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有生物活性廣泛，藥理作用獨(dú)特等特點(diǎn)，但其化學(xué)成分復(fù)雜。隨著分析技術(shù)的革新，人參主要的化學(xué)成分得到了進(jìn)一步的明確。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷是人參主要的生物活性物質(zhì)，到目前為止，已經(jīng)分離鑒定180余種人參皂苷單體，其中5種主要皂苷(人參皂苷Rbl、Rb2、Rc、Re和Rgl)占總皂苷的80%以上，而人參皂苷(Rhl、Rh2、Compound K、Rg2、Fl和Rg3 )含量很低，稱為稀有皂苷(App I i edMicrob1logy and B1technology ,2012,94:673-682)，但其藥理活性優(yōu)于上述高含量的人參皂苷。
[0003]稀有人參皂苷20(S)_Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、粘附侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，提高機(jī)體免疫機(jī)能等生理作用。但稀有皂苷20(S)-Rg3在植物中含量很低，直接提取工藝復(fù)雜，成本太高。而人參皂苷Rbl、Rb2和Re是人參總皂苷中含量最高的幾種人參皂苷。它們與稀有人參皂苷20(S)-Rg3具有相似的母核結(jié)構(gòu)，唯一的差別是在20位上的糖基側(cè)鏈(圖1)。如果能專一性的切除Rbl、Rb2和Re在20位上的糖基側(cè)鏈，就可以得到稀有人參皂苷20(S)-Rg3。
[0004]將人參皂苷Rbl、Rb2、Rc轉(zhuǎn)化為20(S)_Rg3的方法有化學(xué)法和生物法。但化學(xué)轉(zhuǎn)化法因其反應(yīng)劇烈、選擇性差、無法得到20(S)-Rg3純品等缺點(diǎn)而不被采用。生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和，特異性好等特點(diǎn)，而受到青睞。如Cheng等發(fā)現(xiàn)新細(xì)菌MicrobacteriumSP.GS514能轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl生成稀有人參皂苷20(S)-Rg3，但存在轉(zhuǎn)化周期較長，轉(zhuǎn)化率低下等缺點(diǎn)(Phytochemi s try，2008，69:218-2 24)。本課題組在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)了一種β-葡萄糖苷酶能轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl生成稀有人參皂苷20(S)-Rg3(中國專利201410510836.6)。但目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道能同時(shí)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl、Rb2和Re生成20(S)_Rg3。同時(shí)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl、Rb2和Re，能提高資源利用率和降低人參皂苷原料的提取成本，但各種酶對底物的專一性不同，降解的糖苷鍵類型也各不相同。因此，尋找能高效、特異性降解人參皂苷Rbl、Rb2和Re生產(chǎn)人參皂苷20(S)-Rg3的糖苷水解酶成為了研究關(guān)鍵，同時(shí)選擇的酶必須有相似的最適反應(yīng)PH和溫度，能進(jìn)行協(xié)同降解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提供了一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)_Rg3的方法，該方法所使用的重組酶分別來源于Thermotoga petrophiIa的β-葡萄糖苷酶和Thermotogathermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0006]技術(shù)方案:一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)_Rg3的方法，利用來源于ThermotogapetrophiIa的β-葡萄糖苷酶和Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人參皂苷Rbl、Rb2和Re生產(chǎn)20(S)-Rg3。
[0007]上述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]上述阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示ο
[0009]上述β-葡萄糖苷酶是通過重組表達(dá)制備的，步驟為:
[0010](I)以提取的Thermotoga petrophila基因組DNA為模板，用具有SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴(kuò)增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
[0011](2)將β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì)粒；
[0012](3)將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Ε.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)β-葡萄糖苷酶表達(dá)，收集菌體，破碎細(xì)胞，70 0C熱處理30分鐘，獲得純化的β_葡萄糖苷酶。
[0013]上述阿拉伯呋喃糖苷酶是通過重組表達(dá)制備的，步驟為:
[0014](I)以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因組DNA為模板，用具有SEQID NO:7所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴(kuò)增得到阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子；
[0015](2)將阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子和pET_28a分別用Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化得到含有阿拉伯呋喃糖苷的DNA分子的重組質(zhì)粒；
[0016](3)將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)阿拉伯呋喃糖苷表達(dá)，收集菌體，破碎細(xì)胞，70 0C熱處理30分鐘，離心獲阿拉伯呋喃糖苷。
[0017]酶法制備稀有人參皂苷20(S)_Rg3的方法，降解條件為:Rbl、Rb2、Rc各Ig/L，f3_葡萄糖苷酶0.15U，阿拉伯呋喃糖苷酶0.6U，pH 5.0，85°C條件下，降解Ih，最終可以將人參皂苷Rbl、Rb2、Rc轉(zhuǎn)化為人參皂苷20(S)-Rg3，摩爾得率為97.3%。
[0018]有益效果:
[0019]1.本發(fā)明可以同時(shí)對人參皂苷Rbl、Rb2和Re轉(zhuǎn)化生成20(S)_Rg3，可以提高資源利用率和降低人參皂苷原料的提取成本。
[0020]2.本發(fā)明中的酶對Rbl、Rb2和Re轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，本發(fā)明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能在Ih內(nèi)幾乎將人參皂苷Rbl、Rb2和Re完全轉(zhuǎn)化為20(S)-Rg3。
[0021 ] 3.本發(fā)明中所述的β_葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶專一性強(qiáng)，能特異性降解20位側(cè)鏈上的糖基，幾乎無反應(yīng)副產(chǎn)物。
[0022]4.本發(fā)明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能協(xié)同降解，具有相似的最適反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明中Rbl、Rb2、Rc和20(S)_Rg3的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的溫度對糖苷酶活性的影響；
[0025]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的pH對糖苷酶活性的影響；
[0026]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶對人參皂苷Rbl、Rb2、Rc的轉(zhuǎn)化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅為本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，其中，如無特殊說明，實(shí)施例中涉及的各種反應(yīng)試劑均可以通過商業(yè)渠道購買得到;如無特殊說明，實(shí)施例中涉及的具體操作參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》。
[0029]實(shí)施例1:重組質(zhì)粒pET-20b_bgl的構(gòu)建
[0030]I.IThermotoga petrophila的培養(yǎng)
[0031 ] Thermotoga petrophi I a購于D SMZ菌種保藏中心(www.dsmz.de)編號為D SM13995 ο其培養(yǎng)基配方為:10g/L可溶性淀粉，3g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L肉浸液，10g/L2-嗎啉乙磺酸，10mg/L七水合硫酸鐵，lmg/L刃天青，調(diào)pH為7.2，煮沸充氮?dú)?，除去氧氣后，培養(yǎng)基在無氧條件下裝入?yún)捬跗繙缇?。用注射器按?.5wt接種量接種，85°C靜止培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。
[0032]1.2基因組DNA的提取
[0033](I)靜置培養(yǎng)Thermotoga petrophila 24h，取30mL菌液4，000g離心1min收集細(xì)胞。
[0034](2)用9.5mL TE緩沖液重懸菌體，加入0.5mL 1wt十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均勻，37°C保溫Ih。
[0035](3)加入 1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)/NaCl，混勻，65°C 溫育 20min。
[0036](4)加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，混勻，6，OOOg離心1min。
[0037](5)為防止剪切力造成基因組DNA斷裂，用粗口吸管將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積酸/氯仿/異戊醇混勾(體積比25:24: I) ,6,OOOg離心1min。
[0038](6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動至白色絲狀DNA沉淀清晰可見。
[0039](7)用吸管將DNA纏繞其上，在70vt.%酒精中清洗。
[0040](8)用無菌牙簽將DNA從吸管上刮下，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。
[0041 ] (9)室溫下風(fēng)干，加500yL TE緩沖液溶解。
[0042 ] (10)取50yL用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。
[0043]1.3重組質(zhì)粒pET-20b_bgl的構(gòu)建
[0044]按照已知的Thermotoga petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因(YP_001244492.1)設(shè)計(jì)引物(SEQ ID Ν0:5)下劃線表示Nde I酶切位點(diǎn)；(SEQ ID Ν0:6)下劃線表示Xho I酶切位點(diǎn)，并去除終止密碼子；以提取的Thermotoga petrophila的基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的條件是95°C，3min;30次循環(huán)(94°C，30s;58°C，30s;72°C，2min I Os); 72 °C，I Omin;反應(yīng)停止，4 °C保溫。通過凝膠回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。得到Thermotoga petrophiIa極耐熱β-葡萄糖苷酶基因。
[0045]得到Thermotoga petrophi Ia極耐熱β-葡萄糖苷酶基因和pET_20b分別用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)固體培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)，接種幾個單菌落到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-10小時(shí)后，收集菌體提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證去除空載質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測定，得到正確的重組表達(dá)載體pET20b-bgl。
[0046]2.重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的表達(dá)及純化
[0047]將重組質(zhì)粒pET-20b_bgl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100yg/mL)的LB平板(LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L)上經(jīng)過37 °C培養(yǎng)過夜，挑轉(zhuǎn)