一種快速檢測(cè)副雞禽桿菌的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及試劑盒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)設(shè)及一種快速檢測(cè)副雞禽桿菌的試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 副雞禽桿菌是細(xì)小的革蘭氏陰性菌，細(xì)菌長(zhǎng)約1-3皿，寬0.4-0.8皿，無(wú)鞭毛，不形 成芽抱，毒力菌株往往有芙膜。副雞禽桿菌培養(yǎng)條件較為苛刻，需要在培養(yǎng)基中加入MD，但 在南非也發(fā)現(xiàn)NAD非依賴性分離株，說(shuō)明NAD不是必需的營(yíng)養(yǎng)成分。該菌兼性厭氧，在固體培 養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)需厭氧環(huán)境或3%-10%的C〇2。基于血凝抑制試驗(yàn)建立起來(lái)化ge方法將副雞 禽桿菌分為A、B、CS種血清型。副雞禽桿菌引起的疾病叫做雞傳染性鼻炎。病雞精神委頓， 垂頭縮頸，食欲明顯降低。最初自鼻孔流出水樣汁液，繼而轉(zhuǎn)為漿性黏性分泌物，雞只有時(shí) 甩頭，打噴曖，眼結(jié)膜發(fā)炎，眼險(xiǎn)腫脹，有的流淚，一側(cè)或兩則顏面腫脹，部分病雞可見下頌 部或肉養(yǎng)水腫。該病潛伏期短，傳播迅速，短時(shí)間內(nèi)便可波及全群。育成雞表現(xiàn)為生長(zhǎng)不良， 產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量明顯下降，處在產(chǎn)蛋高峰期的雞群產(chǎn)蛋量大幅度下降10%-40%，有時(shí)高達(dá) 70 %至完全停產(chǎn)。混合感染時(shí)可引起病雞死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的損失。
[0003] 目前進(jìn)行細(xì)菌分類鑒定中常用的祀基因是16S rRNA，它是細(xì)菌染色體上編碼rRNA 相對(duì)應(yīng)的DNA序列，具有高度的保守性，16s rRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的 一種強(qiáng)有力工具。副雞禽桿菌的生化反應(yīng)復(fù)雜，不同毒力的菌株會(huì)有不同的結(jié)果；間接血凝 試驗(yàn)雖是目前最準(zhǔn)確有效的方法，但此方法用時(shí)較長(zhǎng);PCR檢測(cè)方法雖然特異性強(qiáng)，但是需 要的PCR擴(kuò)增儀十分昂貴。因此，發(fā)明一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速的檢測(cè)副雞禽桿菌的方法對(duì) 雞傳染性鼻炎預(yù)防和治療具有重要意義。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)（loop-mediated isothermal amplication,簡(jiǎn)稱LAMP) (國(guó)際專利公開號(hào)WOOO/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，其特點(diǎn)是 針對(duì)祀基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換型DNA聚合酶，能在等溫條件下(60~ 65°C )，化內(nèi)特異地?cái)U(kuò)增出IO9-IOiD拷貝祀序列，擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦憐酸儀沉 淀通過(guò)肉眼進(jìn)行判斷或檢測(cè)其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的巧光染料優(yōu)選SYBR Green I染色， 即可通過(guò)肉眼判定。在保持傳統(tǒng)PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性，同時(shí) 縮短了檢測(cè)時(shí)間。國(guó)內(nèi)外在病原體的檢測(cè)方法，利用LAMP方法對(duì)多種動(dòng)物疫病和微生物檢 測(cè)已有很多報(bào)告。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度和精確度、操作簡(jiǎn) 便的檢測(cè)副雞禽桿菌的試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0006] 首先，本發(fā)明的第一個(gè)技術(shù)目的是提供一種高靈敏度、高特異性的用于檢測(cè)副雞 禽桿菌的LAMP引物組，包括:外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP和BIP，所述的外引物F3和B3的核巧 酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示，所述的內(nèi)引物FIP和BIP的核巧酸序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0007]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)副雞禽桿菌的試劑 盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
[000引所述試劑盒為L(zhǎng)AMP試劑盒，除了包含上述引物組外，還包括:LAMP緩沖液、BstDNA 聚合酶、dNTPs、無(wú)菌去離子水、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。如果采用巧光目視法時(shí)，還包括巧光 染料。
[0009] 優(yōu)選的，本發(fā)明的試劑盒中LAMP引物組的濃度為:外引物F3和B3的濃度為SpmolAi L內(nèi)引物FIP和BIP的濃度為40pmolAiL。
[0010] 更為優(yōu)選的，本發(fā)明的試劑盒包括：
[00川 1H0XLAMP緩沖液；2)8000U/mL BstDNA聚合酶；3)10mM dNTPs;4)LAMP引物組；5) 無(wú)菌去離子水;6)巧光染料：10 X SYBR GreenI; 7)陽(yáng)性對(duì)照：0083、022和Modesto副雞禽桿 菌基因組DNA;陰性對(duì)照:無(wú)菌去離子水。
[0012] 其中所述的10XLAMP緩沖液含有25°C下抑8.8的200mM Tris-HCiaoomM氯化鐘、 IOOmM硫酸錠、20mM硫酸儀、8M甜菜堿和體積百分濃度為1 %的曲拉通X-100。
[0013] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種采用上述的試劑盒快速檢測(cè)副雞禽桿菌的方法。其 中反應(yīng)體系優(yōu)選為：每25化反應(yīng)液中，引物組的引物用量為各IiiUBstDNA聚合酶1化， lOmmol/L的dNTPs3.扣L，待檢樣品DNA2~化L，無(wú)菌去離子水適量;反應(yīng)條件為:65°C恒溫反 應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)lOmin。其中待檢樣品基因組DNA按常規(guī)方法提取或試劑盒提取。
[0014] 當(dāng)試劑盒采用巧光目視法時(shí)，反應(yīng)體系中還包括10XSYBR Green I 2.化L，反應(yīng) 體系總量保持25.0化不變。
[0015] 本發(fā)明試劑盒反應(yīng)完成后肉眼觀察液體變混濁(如果加入巧光染料則顏色由澄色 變?yōu)榫G色），則說(shuō)明樣品中含有副雞禽桿菌;或使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性則可 呈現(xiàn)典型的特異梯狀條帶，陰性則無(wú)此現(xiàn)象。
[0016] 本發(fā)明的試劑盒W及檢測(cè)方法具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1)快速高效:整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程僅需35~50min，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9-IQi日個(gè)拷貝祀序列；
[0018] 2)操作便捷:不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變 性等繁瑣步驟，只需要普通水浴鍋即可進(jìn)行檢巧
[0019] 3)特異性強(qiáng):本發(fā)明根據(jù)副雞禽桿菌16s DNA序列設(shè)計(jì)4條特異性引物，應(yīng)用上述 引物，擴(kuò)增祀序列的4個(gè)區(qū)域，4個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其 特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，確保反應(yīng)的順利進(jìn)行；
[0020] 4)靈敏度高:最低檢測(cè)極限可達(dá)到0.5~0.化g/管，比普通PCR高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)；
[0021] 5)適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)：肉眼觀察液體變渾濁即為陽(yáng)性，澄清透明則為陰性;若采用巧光 目視法觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色為陽(yáng)性，澄色為陰性;或使用2%濃度瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，陽(yáng)性可呈現(xiàn)典型的特異梯狀條帶，陰性無(wú)此現(xiàn)象。
[0022] 本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，不需要配置相關(guān)檢測(cè)儀器，為副雞禽桿菌的檢測(cè)提供了新的技術(shù)支撐，可用于 畜牧業(yè)生產(chǎn)單位、獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、屠宰場(chǎng)、出入境和各疾病預(yù)防控制中屯、篩查和檢測(cè)，具 有廣闊的市場(chǎng)前景，適于推廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的外引物與內(nèi)引物比例優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果圖；M為DL-SOOOmarker，泳道號(hào)1-6分別為外、內(nèi)引物比1: 5，1:6，1: 7，1: 8，1:9，1:10，泳道7為陰性對(duì) 照；
[0024] 圖2為本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的引物缺省試驗(yàn)結(jié)果圖；M為化-SOOOmarker; 1-7分別 為內(nèi)外引物全有;無(wú)上游外引物F3;無(wú)下游外引物B3;無(wú)上游內(nèi)引物BIP;無(wú)下游內(nèi)引物FIP; 無(wú)上、下游外引物F3、B3;無(wú)上、下游內(nèi)引物FIB、BIP;泳道8為陰性對(duì)照；
[002引圖3為本發(fā)明LAMP檢測(cè)體系中不同濃度Mg2+試驗(yàn)結(jié)果圖;1為0心5000111曰'1?5^ 1-6分 別為濃度SmM、6mM、7mM、SmM、9mM、1 OmM 的 MgS04; 7為陰性對(duì)照；
[0026] 圖4為本發(fā)明LAMP檢測(cè)體系中不同濃度Bst DNA聚合酶試驗(yàn)結(jié)果圖；M為DL-SOOOmarker; 1-6分別對(duì)應(yīng)BstDNA polymerase添加量依次為0.4化、0 .化L、0.如L、1.0化、 1.化L、l.化L;7為陰性對(duì)照；
[0027] 圖5為本發(fā)明LAMP檢測(cè)體系中不同濃度dNTPs試驗(yàn)結(jié)果圖;]\C%Dk5000marker; 1-7 分別對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系中的dNTPs的濃度依次為0.8mnK)L/L、1 .OmiroL/L、1.2mnK)L/L、1.4mnK)L/L、 1.6mmoL/L、1.8mmoL/L、2. OmmoL/L; 8為陰性對(duì)照；
[002引圖6為本發(fā)明LAMP檢測(cè)條件的不同反應(yīng)溫度試驗(yàn)結(jié)果圖；M為化-5000marker; 1-7 分別對(duì)應(yīng)溫度梯度為61.0 °C、62.0 °C、63.0 °C、64.0 °C、65.0 °C、