一種產(chǎn)堿桿菌熒光定量的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種產(chǎn)堿桿菌巧光定量的試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)堿桿菌是一種條件致病菌，是一種革蘭染色陰性桿菌，常在有水的環(huán)境中生存， 主要來自潮濕環(huán)境，如霧化器、呼吸機(jī)和灌洗液等。臨床分離最常見的是糞產(chǎn)堿桿菌，大部 分感染是條件致病，血、疲、尿、腦脊液等是常見的發(fā)現(xiàn)部位，是醫(yī)院感染的病原菌之一。由 于該菌對許多抗菌藥具有天然的耐藥性，W及隨著廣譜抗菌藥物的濫用和侵入性醫(yī)療操作 的開展，該細(xì)菌導(dǎo)致的機(jī)會性感染逐漸增多，死亡率高達(dá)15%~48%。但現(xiàn)在的檢測方法還 比較落后，主要是采用鏡檢、分離培養(yǎng)和生化檢測，其檢測效果并不理想，準(zhǔn)確度差且耗時(shí) 長。
[0003] 巧光PCR技術(shù)在1995年由美國陽公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜 交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化。與普通 PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污 染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是:產(chǎn)堿桿菌感染早期診斷困難，現(xiàn)有技術(shù)的 診斷產(chǎn)品和診斷方法敏感性低、陽性率低，導(dǎo)致病情延誤。
[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了產(chǎn)堿桿菌巧光定量PC時(shí)式劑盒，用來解決現(xiàn)有的 產(chǎn)堿桿菌感染診斷困難，敏感性低、陽性率低的問題。本發(fā)明采用先進(jìn)的分子診斷方法，采 用巧光PCR法早期、快速、簡便、敏感、特異檢測產(chǎn)堿桿菌。
[0006] 具體而言，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)堿桿菌巧光定量的試劑盒，包括用于產(chǎn)堿桿 菌定量檢測的特異性引物序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，W及特異性探針序列SEQ ID No. 3。
[0007] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品中包含有插入了產(chǎn)堿桿 菌特異性DNA序列SEQ ID No.4的重組質(zhì)粒。
[000引優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒的濃度為1 .OX IO3~1 .OX IO7拷貝數(shù)。
[0009] 優(yōu)選的，用于所述特異性DNA序列SEQ ID No. 4擴(kuò)增的引物序列為SEQ ID No. 5和 沈Q ID No.6。
[0010] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性標(biāo)準(zhǔn)品，所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品包含有不含產(chǎn)堿桿菌特 異性DNA序列的質(zhì)粒。
[00川優(yōu)選的，所述的質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒相同，選自祀了3、91]〔3、961-1'、981?22、910-1'中的 一種，優(yōu)選為pGM-T、地R322。
[0012] 優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括緩沖液、DNA聚合酶和dNTPs。
[0013] 優(yōu)選的，所述的緩沖液包括=?甲基氨基甲燒、氯化鐘和氯化儀。
[0014] 優(yōu)選的，所述的=徑甲基氨基甲燒的濃度為50~200mM;氯化鐘的濃度為300~ SOOmM;氯化儀的濃度為10~30mM。
[0015] 更優(yōu)選的，所述的=徑甲基氨基甲燒的濃度為100~150mM;氯化鐘的濃度400~ 600mM;氯化儀的濃度為10~20mM。
[0016] 優(yōu)選的，所述特異性探針為帶有巧光基團(tuán)和澤滅基團(tuán)的特異性序列，其中，所述的 巧光基團(tuán)選自FAM、皿X、TET、VIC中的一種，優(yōu)選為FAM、VIC;所述的澤滅基團(tuán)選自MGB、 TAMRA、B冊中的一種，優(yōu)選為MGB。
[0017]同時(shí)，本發(fā)明提供了特異性引物序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2, W及特異性探 針序列SEQ ID No.3在制備產(chǎn)堿桿菌含量測定和/或檢測用試劑中的應(yīng)用。
[0018]優(yōu)選的，所述的產(chǎn)堿桿菌含量測定和/或檢測用試劑的使用方法如下：
[0019] 分別在陽性標(biāo)準(zhǔn)品組、陰性標(biāo)準(zhǔn)品組W及樣品DNA組中加入用于產(chǎn)堿桿菌定量檢 測的特異性引物序列SEQ ID No. USEQ ID No.2和特異性探針序列SEQ ID No.3W及DNA聚 合酶，混合均勻后進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)。
[0020] 優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR反應(yīng)條件為：94~95°C預(yù)變性2~5min，l個(gè)循環(huán);94 ~95°C15 ~20s、55 ~60°C30 ~50s，40 ~50 個(gè)循環(huán)。
[0021] 其中，所述的質(zhì)?？蒞為本領(lǐng)域常用的任何可插入外源基因的質(zhì)粒，可W為常見 的祀Ts系列、pUCs系列、PBR322、pGM-T等，pUCs系列優(yōu)選為pUCl 8、pUCl 9等。
[0022] 其中，特異性引物與特異性探針根據(jù)產(chǎn)堿桿菌高度保守序列特性設(shè)計(jì)，用于檢測 產(chǎn)堿桿菌。
[0023] 而且，發(fā)明人通過設(shè)計(jì)引物序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6,創(chuàng)造性的獲得了產(chǎn) 堿桿菌特異性DNA序列SEQ ID No .4,將其與質(zhì)粒載體連接的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，其 檢測的特異性高，靈敏度高。
[0024] 本發(fā)明的有益效果為：
[0025] 1)本發(fā)明試劑盒定量準(zhǔn)確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精 確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀 察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。
[0026] 2)本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度和特異性高，由于采取特異性引物和探針的雙保險(xiǎn)設(shè) 計(jì)，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測到產(chǎn)堿桿菌的感染。
[0027] 3)本發(fā)明試劑盒檢測速度快，總共僅需2個(gè)小時(shí)，步驟簡單，可同時(shí)進(jìn)行高通量樣 本檢測。
[0028] 下面結(jié)合附圖和各個(gè)【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行詳細(xì)說明， 其中：
【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)施例一的產(chǎn)堿桿菌陽性標(biāo)準(zhǔn)品的巧光PCR擴(kuò)增曲線和陰性標(biāo)準(zhǔn)品的巧光 PCR擴(kuò)增曲線圖。
[0030] 圖2為實(shí)施例一的產(chǎn)堿桿菌臨床樣本的巧光PCR擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 如上所述，本發(fā)明的目的是為了提高被測人群產(chǎn)堿桿菌診斷的靈敏度和特異性， 提供早期診斷的可靠性。
[0032] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)堿桿菌定量檢測巧光PCR 試劑盒，包括用于產(chǎn)堿桿菌定量檢測的特異性引物序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，W及 特異性探針序列SEQ ID No.3。
[0033] 其中，特異性引物 1 的序列沈Q ID No. 1 為：5'-gggttgtaaagtacttttggcagag-3'， 作為正向引物；
[0034] 特異性引物2的序列沈Q ID No.2為：5'-tggcacgtagttagccggtg-3'，作為反向引 物；
[OO%] 特異性探針的序列56〇10齡.3為：5'-1旨(：1旨曰。旨旨1曰1：(31旨。曰旨-3'。在本發(fā)明的具體 實(shí)施中，所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品含有重組質(zhì)粒的濃度化.0 X IO3~1.0 X 107。
[0036] 本發(fā)明中的樣本DNA不僅僅來源于動物或人體的腦脊液或者肺泡灌洗液，還可W 是任何與產(chǎn)堿桿菌相關(guān)的樣本。
[0037] 本發(fā)明提到的特異性引物1的序列SEQ ID No. 1和引物2的序列SEQ ID No.2W及 特異性探針的序列SEQ ID No.3可W應(yīng)用于制備測量產(chǎn)堿桿菌含量的試劑。
[0038] 應(yīng)當(dāng)說明的是，實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員 常規(guī)的方法，具體可參照薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第=版，或按照 制造廠商所建議的步驟和條件。
[0039] 其中，本發(fā)明中所有的Buffer緩沖液可W購買，也可W自己配制，本發(fā)明中所用到 的核巧酸序列的表達(dá)方式采用本領(lǐng)域通用的表達(dá)方式，即從5 '端到3 '端。
[0040] 下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中實(shí)施例中所用 的試劑和儀器的廠家如下：
[0041 ]巧光定量PCR儀，廠家:美國ABI實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀7500，美國；
[0042] dNTPs，廠家:TAKARA，日本；
[0043] Taq DNA聚合酶，型號:R007A，廠家:TAKARA，日本；
[0044] DNA基因組提取試劑盒，型號:DP304，購自天根公司；
[0045] pGM-T載體連接試劑盒，PUC18載體連接試劑盒，PMD18-T載體連接試劑盒，均購自 天根生化科技(北京)有限公司；
[0046] 緩沖液，型號:9151A，購買廠家:TAKARA，日本
[0047] 本發(fā)明中用到的特異性引物，W及特異性探針序列均由上海英驗(yàn)生物技術(shù)有限公 司合成，其中，特異性探針上連接的巧光基團(tuán)和澤滅基團(tuán)一并由上海英俊生物技術(shù)有限公 司合成。
[004引實(shí)施例一
[0049] 在該實(shí)施例中制備具有如下組成的產(chǎn)堿桿菌巧光定量試劑盒:包括用于產(chǎn)堿桿菌 定量檢測的特異性引物序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2, W及特異性探針序列SEQ ID No. 3。
[0050] (一)試劑盒的準(zhǔn)備
[0051] (I)產(chǎn)堿桿菌陽性模板的制備
[0052] 制備含有產(chǎn)堿桿菌核酸序列的質(zhì)粒作為陽性模板，從而將其在試劑盒檢測時(shí)作為 陽性對照。
[0053] 首先選取患有產(chǎn)堿桿菌的樣本，利用DNA基因組提取試劑盒上的操作說明提取全 基因組DNA，然后使用引物沈Q ID No.5:5'-ctgatccagccatcccgc-3'和引物沈Q ID No.6: 5'-tttctttccgaaccgcctacac-3'，采用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)堿桿菌基因祀序列，擴(kuò)增體系見 表1。
[0化4] 表1 PCR擴(kuò)增體系 擴(kuò)増衆(zhòng)件刃：95 "U，5min
[0化7] 60°C，30s，72°C，30s;共計(jì)30個(gè)循環(huán)；
[005引 72°C，IOmin
[0059] 其中得到的產(chǎn)堿桿菌基因祀序列為SEQ ID No.4,其中SEQ ID No.4序列如下：
[
[0061 ]然后采用pGM-T載體連接試劑盒，將PCR產(chǎn)物連接到pGM-T載體上，得到連接有目的 基因的質(zhì)粒;接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，并通過篩選構(gòu)建好的重組質(zhì)粒作為陽性 標(biāo)準(zhǔn)品，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙向DNA測序鑒定，提取質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)定量，并保存 于-2(TC。
[0062] (2)陰性模板
[006；3]將1.0 X IO7拷貝數(shù)的不含產(chǎn)堿桿菌特異御NA序列的pGM-T質(zhì)粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)