一種用ApoI檢測人胃癌易感基因IL17A rs3748067多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種用Apo I檢測人胃癌易感基因ILl 7A rs3748067多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性（single nucleotide polymor曲ism,SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。占所有已知多態(tài)性的90% W上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個(gè)堿基 對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。CAPs ( C1 eaved ampl if i cat ion POlymo;rphism sequence-tagged sites)CAPs技術(shù)又稱為PCR-RFLP，限制性片段長度多態(tài) 性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再 用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制 性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量 和相對(duì)特異性，而且方法簡便，分型時(shí)間短。運(yùn)種方法與RFLP相比，不同的是W擴(kuò)增替代了 酶切，避免了 RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟。
[0003] 全世界范圍內(nèi)，胃癌仍然是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生是 一個(gè)多步驟，多因素，多階段，多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，包括基因因素，生物因素W及多種 環(huán)境危險(xiǎn)因素。盡管近年來胃癌的死亡率已有顯著的下降，但胃癌的五年生存率依舊很低。 炎癥反應(yīng)與腫瘤關(guān)系的研究一直是相關(guān)學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，大量研究結(jié)果表明胃部幽口螺桿 菌感染與胃慢性炎癥關(guān)系密切。幽口螺桿菌感染與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子尤其是白介素家族 顯著相關(guān)。越來越多的研究在胃癌組織W及幽口螺桿菌感染相關(guān)胃炎組織中發(fā)現(xiàn)多種炎性 細(xì)胞因子，如IL17AJL23R等的表達(dá)量顯著升高。因此，研究胃癌基因遺傳多樣性很有必要。 作為一類重要的細(xì)胞因子，IL17家族基因可參與廣泛的生理過程，其中一個(gè)重要的角色是 調(diào)節(jié)急性W及慢性炎癥性疾病。IL17家族在幽口螺桿菌定植所引起的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要 作用，同時(shí)也發(fā)揮著非常強(qiáng)的募集中屯、粒細(xì)胞的作用，參與多種慢性炎癥疾病，是導(dǎo)致胃粘 膜萎縮等癌前病變的重要原因。許多研究發(fā)現(xiàn)IL17基因家族的基因多態(tài)性與胃癌易感性相 關(guān)。近年來IL17A在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了較大進(jìn)展，但其在胃癌領(lǐng)域的研究開展相對(duì)較 少，因此將一定功能相關(guān)的IL17A位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌結(jié)合起來可W更好的探討其對(duì)胃癌形 成過程的作用，掲示其與胃癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性進(jìn)而探討其中的具體分子機(jī)制。
[0004] 序列特異性引物PCR也稱等位基因特異性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于Taq DNA 多聚酶不能修復(fù)DNA引物在y末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配。所W，當(dāng)引物的y端核巧酸與等位基因 變異部位序列互補(bǔ)，則模板被擴(kuò)增。但是，當(dāng)引物y端核巧酸與模板錯(cuò)配，則模板不會(huì)被擴(kuò) 增或擴(kuò)增效率極低。每個(gè)等位基因的檢測，需設(shè)計(jì)兩套引物，一套為等位基因特異性引物， 一套為普通引物。PCR產(chǎn)物凝膠電泳W(wǎng)后，DNA的存在與否通過紫外線透射來檢測，DNA條帶 的存在或缺失即可確定基因型。在同一反應(yīng)中的另一對(duì)引物(通常擴(kuò)增人生長激素基因的 一段)總會(huì)產(chǎn)生一個(gè)DM片斷，與HPA基因型無關(guān)，作為PCR有效性的控制。
[000引基因特異性PCR(AS-PCR)的缺點(diǎn)是擴(kuò)增效率較低，擴(kuò)增特異性差，因此PCR產(chǎn)物的 特異性與穩(wěn)定性無法保障，同時(shí)，分型結(jié)果也較容易誤判，穩(wěn)定性較差。
[0006] 化qMan探針法是指PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的巧光 探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5/端標(biāo)記有巧光 報(bào)告基團(tuán)（Repoder，R)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有巧光澤滅基團(tuán)（Quencher，Q)，如TAMRA 等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5/端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的巧光正好被近距離的3/端巧光基 團(tuán)澤滅，儀器檢測不到5/端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的巧光信號(hào)（就是說5'巧光基團(tuán)的發(fā)射波長正 好是3'巧光基團(tuán)的吸收波長，因而能量被吸收傳遞到3'巧光基團(tuán)而發(fā)出其它巧光）。隨著 PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5/ -3/外切酶活性(此活性是 雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會(huì)將切割探針，釋放5/端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng) 體系中，遠(yuǎn)離3/端巧光澤滅基團(tuán)的屏蔽，5/端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的巧光信號(hào)就可W被 探頭檢測到。也就是說每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)巧光分子形成，實(shí)現(xiàn)了巧光信號(hào)的累積 與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
[0007] Taqman巧光探針法需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高，難W在實(shí)驗(yàn)室中普 及使用。
[000引染料法基因定性分析化RM)的主要原理是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量W及堿基互 補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的烙解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，其極高的溫度均一性和溫度分辨率 使分辨精度可W達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。
[0009] 染料法基因定性分析方法的缺點(diǎn)在于由于染料法特異性不強(qiáng)，只要是雙鏈的DNA 都會(huì)結(jié)合發(fā)光，因此，特異性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用ApoI檢測人胃癌易感基因 IL17A rs3748067多態(tài)性的方法，該方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段，然后 將待檢測的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切，限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割特異的序列，然后將酶 切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再由限制酶圖譜(res化iction map)分析此段序列的特異切位點(diǎn)，藉 由片段的多樣性來比對(duì)不同來源基因序列的差異性。簡而言之，就是先PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的片 斷，而后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切反應(yīng)，電泳后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。此 方法重復(fù)性好，操作較簡單，成本低，酶切結(jié)果容易辨識(shí)。因此，本發(fā)明的目的是提供一種操 作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人胃癌易感基因IL17A多態(tài)性rs3748067的方法及檢 測試劑盒。
[0011] 其技術(shù)方案如下：
[001^ -種用ApoI檢測人胃癌易感基因IL17A rs3748067多態(tài)性的方法，包括W下步驟：
[0013] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0014] (b)提供擴(kuò)增人IL17A基因多態(tài)性rs3748067位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引 物，rs3748067上游引物：5 ' -AGGATGGAGTGAAGAGGAA-3 '，rs3748067下游引物：5 ' -AGAGATCAACAGACCAACAT-3 '，W步驟(a)提取的待測人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取 擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] (C)使用限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟(b)中獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn) 物；
[0016] (d)將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，W判定IL17A基因多態(tài)性 rs3748067的各基因型。其中，經(jīng)電泳后有一條條帶者為GG基因型，兩條條帶者為AG基因型， S條條帶者為AA基因型。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[001引本發(fā)明提供了一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人胃癌易感基因IL17A 多態(tài)性rs3748067的方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)rs3748067帶有A等位基因（尤其是AG基因 型）的個(gè)體胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于帶有GG基因型個(gè)體。在此背景下提供此方便、快捷的檢 測人胃癌易感基因IL17A多態(tài)性rs3748067的方法有望預(yù)測胃癌的易感性，可用于臨床的早 期診斷。
【附圖說明】
[0019] 圖1是L17A rs3748067位點(diǎn)的電泳圖譜；
[0020] 圖2是IL17A rs3748067位點(diǎn)GG基因型測序圖譜(反向測序）；
[0021] 圖3是IL17A rs3748067位點(diǎn)AA基因型測序圖譜(反向測序）；
[0022] 圖4是IL