一種用BccI鑒定人乳腺癌RAD51基因rs7180135多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種用BccI鑒定人乳腺癌RAD51基因rs7180135多 態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性（single nucleotide polymor曲ism,SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。占所有已知多態(tài)性的90% W上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個堿基 對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。CAPs ( C1 eaved ampl if i cat ion POlymo;rphism sequence-tagged sites)CAPs技術(shù)又稱為PCR-RFLP，限制性片段長度多態(tài) 性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產(chǎn)物再 用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制 性酶切位點分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項技術(shù)大大提高了目的DNA的含量 和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。運種方法與RFLP相比，不同的是W擴增替代了 酶切，避免了 RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟。
[0003] RAD51基因（RADSlrecombinase)位于人類染色體15ql5.1，該基因編碼的蛋白質(zhì)是 RAD51蛋白家族的一個成員。RadSl蛋白家族成員與細菌RecA和釀酒酵母RadSl蛋白高度相 似，現(xiàn)在公認其參與DNA同源重組修復(fù)。運種蛋白通過與單鏈DNA結(jié)合蛋白RPA和RAD52相互 作用在同源染色體配對和DNA鏈轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。有的研究發(fā)現(xiàn)運種蛋白與BRCAl 和BRCA2基因也存在相互作用，運種相互作用在細胞的DNA損傷反應(yīng)中至關(guān)重要（美國國立 衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術(shù)中屯、，http://www.ncbi .nlm.nih.gov)。已經(jīng)有 研究表明RAD51基因多態(tài)性與多種腫瘤存在關(guān)聯(lián)[1-3]。
[0004] RS7180135位于人RAD51mRNA3'非翻譯區(qū)（3'untranslated region，3'UTR)(美國 國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術(shù)中屯、，http://www.ncbi .nlm.n化.gov)。通 常該多態(tài)在人群中存在S種RAD51基因的基因型:AA型（人基因組rs7180135多態(tài)位點的兩 個等位基因堿基均為A) ,AG型（人基因組rs7180135多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為G 和A)和GG型(人基因組rs7180135多態(tài)位點RAD51的兩個等位基因堿基均為G)。
[0005] 目前人基因多態(tài)rs7180135的鑒定長采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人RAD51基因多 態(tài)rs45549040時常使用的限制性內(nèi)切酶價格昂貴(關(guān)于部分內(nèi)切酶的參考價格可參考后面 的表1 )，實驗成本高，難W在實驗室中普及使用。
[0006] 因此，本領(lǐng)域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP方法的需求。本 領(lǐng)域迫切需要在節(jié)約實驗成本的前提下，通過PCR-RFLP技術(shù)的改進，來開發(fā)經(jīng)濟、快速的檢 測人RAD51rs7180135基因多態(tài)性的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用BccI鑒定人乳腺癌RAD51基 因 rs7180135多態(tài)性的方法，該方法采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法，是采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增目的DNA片段，然后將待檢測的DNA片段用限制 性內(nèi)切酶酶切，限制性內(nèi)切酶識別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進行電泳，再由 限制酶圖譜(res化iction map)分析此段序列的特異切位點，藉由片段的多樣性來比對不 同來源基因序列的差異性。簡而言之，就是先PCR擴增相應(yīng)目的片斷，而后進行限制性內(nèi)切 酶切反應(yīng)，電泳后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。此方法重復(fù)性好，操作較簡 單，成本低，酶切結(jié)果容易辨識。因此，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、成本低、適用范 圍廣泛的檢測人乳腺癌易感基因 RAD51多態(tài)性rs7180135的方法及檢測試劑盒。
[000引其技術(shù)方案如下：
[0009] 一種用BccI鑒定人乳腺癌RAD51基因 rs7180135多態(tài)性的方法，包括W下步驟：
[0010] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0011] (b)提供擴增人RAD51基因多態(tài)性rs7180135位點附近序列的正向引物和反向引 物^37180135上游引物：5'-61'機61'機6441641'(：門616-3'^37180135下游引物：5'-GCAACTTCCACCTTCCAG-3 '，W步驟(a)提取的待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲取擴 增產(chǎn)物.
[0012] (C)使用限制性內(nèi)切酶對步驟(b)中獲取的擴增產(chǎn)物進行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn) 物；
[0013] (d)將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進行電泳，W判定RAD51基因多態(tài)性 rs7180135的各基因型，其中，經(jīng)電泳后有兩條條帶者為GG基因型，S條條帶者為AA基因型， 四條條帶者為AG基因型。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0015] 本發(fā)明提供了 一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人乳腺癌易感基因 RAD51多態(tài)性r S 7180135的方法，提供此方便、快捷的檢測人乳腺癌易感基因 RAD51多態(tài)性 rs7180135的方法有望預(yù)測乳腺癌的易感性，可用于臨床的早期診斷。
【附圖說明】
[0016] 圖1是PCR擴增反應(yīng)程序；
[0017] 圖2是RAD51rs7180135位點的電泳圖譜；
[0018] 圖3是RAD51rs7180135位點GG基因型測序圖譜；
[0019] 圖4是RAD51rs7180135位點AG基因型測序圖譜；
[0020] 圖5是RAD51rs7180135位點AA基因型測序圖譜。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0022] 本發(fā)明提供了一種檢測乳腺癌易感基因的方法，由于識別特定位點的限制性內(nèi)切 酶BccI適用范圍廣，價錢較為經(jīng)濟，進而大大降低了檢測SNP的成本。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測 該G/A多態(tài)的方法可使用表一中的8種酶，其中表中前四種酶均含一錯配堿基，此錯配堿基 的位置離突變位點往往很是接近，運大大增加了引物設(shè)計的難度，加之要求上游或下游引 物必須包含此錯配堿基，運對引物的設(shè)計又增加了新的難度。后面幾種酶并不是常見的酶， 目前在幾家試劑公司均沒有運些酶的出售。綜合考慮簡單操作性與經(jīng)濟實用性，限制性內(nèi) 切酶BccI是不二選擇。
[0023] 表1中提供的限制性內(nèi)切酶的價格從肥B公司化ttp: //www.neb-china. com)，限制 性內(nèi)切酶的選擇從WatCut限制性內(nèi)切酶分析軟件上獲取化ttp: //watcut. water loo. Ca/ template.php?act = 3噸_116?〇，W此作為限制性內(nèi)切酶識別位點和價格的參考。
[0024] 表1幾種限制性內(nèi)切酶識別序列及其價格
[0025]
[0026]
[0027]在本發(fā)明的實施中，正向引物和反向引物的設(shè)計采用Primers.0軟件進行，設(shè)計的 原則綜合考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度W及擴增效率的影響。按照堿基互不配對的 原則設(shè)計引物，引物長度一般在15~30堿基之間，過長或短均會造成特異性差，過長還會導(dǎo) 致其延伸溫度大于74°C，不適于化qDNA聚合酶進行反應(yīng)。引物GC含量在40 %~60 %之間，化 值最好接近72°C，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機分布，引物自身及引物 之間不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。引物5/端和中 間AG值應(yīng)該相對較高，而y端AG值較低。擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物應(yīng)具有 特異性，引物設(shè)計完成W后，應(yīng)對其進行BLAST檢測，W確保其與其它基因不具有互補性。在 此基礎(chǔ)上，最終選取的上游引物：5 ' -GTCTGTCTGAATGATCTTGTG-3 '，下游引物：5 ' -GCAACTTCCACCTTCCAG-3 '。由此引物擴增出的面的片段37化P，擴增產(chǎn)物如下：
[002引 GTCTGTCTGAATGATCTTGTGTAAGGTTTTGGTTATGGAGTCTTGTGCCAAACCTACTAGGCCATTAGCCCTTCACC ATCTACCTGCTTGGTCTTTCATTGCTAAGACTAACTCAAGATAATCCTAGAGTCTTAAAGCATTTCAGGCCAGTGTG GTGTCTTGCGCCTGTACTCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCAGGTGGATCGCTTGAGCCCAGGAGTTTTAAGTCCA GCTTGGCCAAGRTGGTGAAATCCCATCTCTACAAAAAATGCAGAACTTAATCTGGACACACTGTTACACGTGCCTGT AGTCCCAGCTACTCGATAGCCTGAGGTGGGAGAATCACTTAAGCCTGGAAGGTGGAAGTTGC(370bp)
[0029] 下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第243位bpR代表A/G多態(tài)即SNP位點 rs7180135。該長為370bp的擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BccI酶切后可產(chǎn)生178bp，15：3bp， IOSbp，84bp和25bp共五種片段類型?；蛐团卸ńY(jié)果:AA突變基因型，長為84bp，153bp， 108bp和25bp四條帶;GG野生基因型，長為84bp，108bp和178bpS條帶;GA雜合基因型，長為 178bp，153bp，IOSbp，84bp 和 25bp 五條帶。
[0030] 凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙締酷胺凝膠電泳，瓊脂糖(Agarose)是一種 線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻 凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的，可用于DNA片段的制備電 泳。聚丙締酷胺凝膠主要有兩種方式:一是用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙締酷 胺凝膠，二是用于分離及純化單鏈DNA片段的變性聚丙締酷胺凝膠。但綜合考慮實用性、便 利性W及經(jīng)濟性，使用瓊脂糖凝膠電泳不失為一種最佳選擇。