物。一類特殊的IncRNA是長鏈基因間ncRNAs(IincRNA)，指從蛋白 編碼基因之間的非編碼DNA序列轉(zhuǎn)錄的長鏈非編碼RNA。
[0072] 本發(fā)明首次證實，黑素瘤中IncRNA的特異表達(dá)，W及抑制該IncRNA可用來選擇性 誘導(dǎo)運些癌癥細(xì)胞的調(diào)亡。
[0073] 據(jù)此，本發(fā)明的一個目的是，提供LINC01212基因功能性表達(dá)的抑制劑。運種抑制 劑可在DNA水平上或在RNA(即基因產(chǎn)物)水平上起作用。由于LINC01212是非編碼基因，該基 因沒有蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0074] 如果在DNA水平上實現(xiàn)抑制，可W通過使用基因治療敲除或破壞祀標(biāo)基因來進行。 如本文中所使用的，"敲除"可W是基因敲低，或可W將基因敲除，通過使用本領(lǐng)域所知的技 術(shù)，包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移，造成突變，例如點突變、插入、刪除、移碼、或錯義 突變?？蒞將基因敲除的另一方式是，使用鋒指核酸酶。鋒指核酸酶(ZFN)是通過將鋒指DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA切割結(jié)構(gòu)域融合而產(chǎn)生的人工限制性酶。可W對鋒指結(jié)構(gòu)域進行改造 W 祀向目的DNA序列，運可使鋒指核酸酶祀向復(fù)雜基因組中的獨特序列。通過利用內(nèi)源的DNA 修復(fù)機制，運些試劑可用于精確改變高等生物體的基因組。其它可用來敲除基因的基因組 定制技術(shù)有 Meganuc lease和TAL效應(yīng)物核酸酶（TALENs ,Cellectis bioresearch)。 TALEN⑧由用于序列特異性識別的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與引入雙鏈斷裂(DSB)的核酸 內(nèi)切酶的催化結(jié)構(gòu)域融合組成。TALEN⑩的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠高度精確地祀向大的識 別位點（例如17bp) DMeganuclease是序列特異性核酸內(nèi)切酶，是天然產(chǎn)生的"DNA剪刀"，其 源自各種單細(xì)胞生物體例如細(xì)菌、酵母、藻類和某些植物細(xì)胞器。Meganuclease具有12至30 個堿基對的長識別位點?？蒞改變天然Meganuclease的識別位點W使其祀向天然的基因組 DNA序列（例如內(nèi)源基因）。
[0075] 另一個最近的基因組編輯技術(shù)是CRISPR/Cas系統(tǒng)，其可W被用來實現(xiàn)RNA引導(dǎo)的 基因組改造。CRISIS干擾是允許序列特異性控制原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的遺傳技術(shù)。 其基于源自細(xì)菌免疫系統(tǒng)的CRISPR(規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù))通路。
[0076] 基因失活，即基因功能性表達(dá)的抑制，也可W例如通過創(chuàng)造表達(dá)反義RNA的轉(zhuǎn)基因 生物體，或者通過對受試者施用反義RNA來實現(xiàn)。可W例如作為表達(dá)質(zhì)粒來遞送反義構(gòu)建 體，其中當(dāng)所述表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)時，產(chǎn)生與細(xì)胞LINC012121ncRNA的至少一個獨特部 分互補的RNA。
[0077] 用于抑制基因表達(dá)的一個更快方法是，基于使用由DNA或其它合成的結(jié)構(gòu)類型（例 如硫代憐酸醋、2'-0-烷基核糖核巧酸嵌合體、鎖核酸化NA)、膚核酸（PM)或嗎嘟核酸 (morpholino))組成的較短反義寡聚物。除了RNA寡聚物、PNA和嗎嘟核酸W外，所有其它反 義寡聚物都在真核細(xì)胞中通過RNA酶H介導(dǎo)的祀切割機制起作用。PM和嗎嘟核酸高度親和 地和特異地結(jié)合互補的DNA和RNA祀標(biāo)，由此通過對RNA翻譯機器的簡單空間位阻來起作用， 且表現(xiàn)出完全抵抗核酸酶的攻擊。"反義寡聚物"指，包含至少長約10個核巧酸的寡聚物的 反義分子或反基因劑(anti-gene agent)。在實施方案中，反義寡聚物包含至少15、18、20、 25、30、35、40或50個核巧酸。反義方法包括設(shè)計與LINC01212的多核巧酸序列編碼的RNA互 補的寡核巧酸(DNA或RNA或其衍生物）。可W將反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，通過與其堿基配對和物 理上阻礙翻譯機器來抑制互補mRNA的翻譯。該效果因此是化學(xué)計量的。盡管優(yōu)選完全互補， 但運不是必需的。如本文中所提及的，序列與RNA的一部分"互補"，意思是序列具有能夠與 RNA雜交、形成穩(wěn)定的雙鏈體的足夠互補性;在雙鏈反義多核巧酸序列的情況下，可W檢測 雙鏈體DNA的單鏈，或可W檢測S鏈體的形成。雜交的能力將取決于互補的程度和反義多核 巧酸序列的長度。通常，進行雜交的多核巧酸序列越長，其可包含越多的與RNA錯配的堿基 且仍然形成穩(wěn)定的雙鏈體(或=鏈體，視情況而定）。技術(shù)人員可W通過使用標(biāo)準(zhǔn)程序測量 雜交復(fù)合體的烙點，確定錯配的耐受程度。反義寡聚物應(yīng)該長至少10個核巧酸，優(yōu)選寡聚物 長15至約50個核巧酸。在某些實施方案中，寡聚物長至少15個核巧酸、至少18個核巧酸、至 少20個核巧酸、至少25個核巧酸、至少30個核巧酸、至少35個核巧酸、至少40個核巧酸、或至 少50個核巧酸。一個相關(guān)的方法使用核酶替代反義RNA。核酶是具有催化作用的RNA分子，其 具有與酶一樣的切割特性，可W被設(shè)計W祀向特定的RNA序列。在小鼠、斑馬魚和果蛹中報 道了使用核酶的成功祀基因失活，包括時間和組織特異性的基因失活。RNA干擾(RNAi)是一 種轉(zhuǎn)錄后基因沉默形式。RNA干擾現(xiàn)象最初在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中 得到觀察和描述，其中顯示了外源雙鏈RNA(dsRNA)通過誘導(dǎo)祀標(biāo)RNA快速降解的機制可W 特異地和有力地破壞包含同源序列的基因的活性。幾個報道在其它生物體中描述了相同的 催化現(xiàn)象，包括展示在空間上和/或時間上控制基因失活的實驗，所述生物體包括植物(擬 南芥(Arabidopsis thaliana))、原生動物（布氏錐蟲（Tirpanosoma bruceii ))、無脊椎動 物（黑腹果蛹化roso曲ila melanogaster))和脊椎動物物種（斑馬魚（Danio rerio)和非洲 爪贍(Xenopus Iaevis))。介導(dǎo)序列特異性信使RNA降解的可W是小干擾RNA(SiRNAs),其從 較長的dsRNA通過核糖核酸酶III切割產(chǎn)生。通常，SiRNA的長度為20-25個核巧酸巧化ashir 等，（2001)化ture 411,494 498)esiRNA通常包含通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson Crick堿基配對相互 作用(在下文中稱為"堿基配腫'）退火在一起的正義RNA鏈和互補的反義RNA鏈。正義鏈包含 與祀標(biāo)mRNA中的祀標(biāo)序列一致的核酸序列。本發(fā)明的SiRNA的正義和反義鏈可W包含兩個 互補的單鏈RNA分子，或可W包含單個分子，在該單個分子中，兩個互補的部分堿基配對并 通過單鏈"發(fā)夾"區(qū)（通常稱為ShRNA)共價連接。術(shù)語"分離的"意思是通過人為干預(yù)從天然 狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在活體動物中的SiRNA不是"分離的"，但合成的SiRNA或從與 其天然狀態(tài)共存的材料中部分或完全分離的SiRNA是"分離的"。分離的SiRNA可W相當(dāng)純的 形式存在，或可在非天然環(huán)境例如SiRNA所轉(zhuǎn)入的細(xì)胞中存在。
[007引本發(fā)明的S iRNA可W包括部分純化的RNA、相當(dāng)純的RNA、合成的RNA、或重組產(chǎn)生的 RNA、W及通過添加、刪除、替換和/或改變一個或多個核巧酸而與天然存在的RNA不同的經(jīng) 改變了的RNA。運樣的改變可W包括添加非核巧酸材料至例如SiRNA的末端(一個或多個)或 至S iRNA的一個或多個內(nèi)部核巧酸，包括使S iRNA抵抗核酸酶消化的修飾。
[0079]本發(fā)明的SiRNA的一條或兩條鏈也可W包含y突出端。"3/突出端"指從RNA鏈的y 末端伸出來的至少一個非配對的核巧酸。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的SiRNA包含長I 個至約6個核巧酸(包括核糖核酸或脫氧核糖核酸）的至少一個3/突出端，優(yōu)選長1至約5個 核巧酸，更優(yōu)選長1至約4個核巧酸，特別優(yōu)選長約1至約4個核巧酸。
[0080] 在SiRNA分子的兩條鏈都包含y突出端的實施方案中，對于每條鏈，突出端的長度 可W是相同或不同的。在最優(yōu)選的實施方案中，3/突出端存在于SiRNA的兩條鏈上，長2個核 巧酸。為了增強本發(fā)明SiRNA的穩(wěn)定性，也可W使y突出端穩(wěn)定化W對抗降解。在一個實施 方案中，利用包括嚷嶺核巧酸例如腺巧或鳥巧核巧酸來穩(wěn)定突出端。
[0081] 可選的，W經(jīng)修飾的類似物替換喀晚核巧酸，例如W2/脫氧胸巧替換3/突出端中 的尿巧核巧酸，是可耐受的，不影響RNAi降解的效率。特別是，2/脫氧胸巧中的2/徑基的缺 失顯著增強組織培養(yǎng)基中y突出端的核酸酶抗性。
[0082] 本發(fā)明的S i RNA可W祀向任何祀標(biāo)LINCO1212 RNA序列r'祀序列"）中約19至2 5個 連續(xù)核巧酸的任何區(qū)段，在本申請中提供了其實例。用于選擇SiRNA的祀序列的技術(shù)在本領(lǐng) 域公知。因此，本發(fā)明的S iRNA的正義鏈可W包含與祀標(biāo)mRNA中任何一段約19至約25個連續(xù) 的核巧酸一致的核巧酸序列。
[0083] 可W使用許多本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)獲得本發(fā)明的siRNA。例如，可W使用本 領(lǐng)域所知的方法通過化學(xué)合成或重組產(chǎn)生siRNA。優(yōu)選地，使用適當(dāng)保護的核糖核巧亞憐酷 胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀來化學(xué)合成本發(fā)明的SiRNAsSiRNA可W作為兩個分開的、互補的 RNA分子，或作為具有兩個互補區(qū)的單個RNA分子來合成。合成的RNA分子或合成試劑的供應(yīng) 商包括Proli邑O(Hamt)Ur邑，德國），Dharmacon Research(Lafayette,Colo美國），Pierce ChemicaKPerbio Science的分部,Rockford, 111美國），Glen Research(SterIing,Va., 美國），ChemGenes(Ashland)Mass.,美國）和Cruachem(Glasgow,英國）。
[0084] 可選地，也可W使用任何合適的啟動子從重組的環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)siRNA。 用于從質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明SiRNA的合適啟動子包括例如U6或Hl RNA pol III啟動子序列和巨 細(xì)胞病毒啟動子。其它合適的啟動子的選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。本發(fā)明的重組質(zhì)粒也 可W包括用于在特定組織或在特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)SiRNA的可誘導(dǎo)或可調(diào)控啟動子。 從重組質(zhì)粒表達(dá)的SiRNA可W使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離，或可W在細(xì)胞 內(nèi)例如在乳房組織或在神經(jīng)元中表達(dá)。
[00化]也可W從重組病毒載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的siRNA。重組病毒載體包括編碼本 發(fā)明的SiRNA的序列和用于表達(dá)SiRNA序列的任何合適的啟動子。合適的啟動子包括例如U6 或Hl RNA pol III啟動子序列和巨細(xì)胞病毒啟動子。其它合適的啟動子的選擇為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所知。本發(fā)明的重組病毒載體也可W包括用于在腫瘤所位于的組織中表達(dá)SiRNA的 可誘導(dǎo)或可調(diào)控啟動子。
[0086] 如本文中所使用，SiRNA的"有效量"是足夠?qū)е翿NAi介導(dǎo)的祀標(biāo)mRNA降解的量，或 足夠抑制受試者中的轉(zhuǎn)移進程的量?？蒞使用分離和定量mRNA或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如上 述），通過測量受試者細(xì)胞中祀標(biāo)mRNA或蛋白質(zhì)的水平來檢測RNAi介導(dǎo)的祀標(biāo)mRNA降解。
[0087] 通過考慮例如受試者的大小和重量，疾病滲入的程度，受試者的年齡、健康狀況和 性別，給藥途徑，和給藥是局部還是全身性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W容