用于對(duì)nras和braf核酸進(jìn)行多重分析的組合物及方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 根據(jù)35U.S.C.§119(6)，本申請(qǐng)要求2013年8月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/ 865，754的優(yōu)先權(quán)，W引用的方式將其內(nèi)容整體并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)包含序列表，所述序列表已經(jīng)WAScn格式電子提交，并在此W引用的方式 將其整體并入。所述Ascn副本創(chuàng)建于2014年7月29日，命名為046264-078891-PCT_^.txt， 大小為28,830字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本文所述的技術(shù)設(shè)及使得能夠?qū)ν蛔?包括點(diǎn)突變)的存在和/或不存在進(jìn)行檢測(cè) 的測(cè)定法和方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展使得鑒別了當(dāng)被突變和改變時(shí)可引起疾病的基因。例如，在與 野生型或健康受試者相比時(shí)，在患有給定疾病或具有發(fā)展為給定疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者中，編 碼基因的序列可能突變。
[0007] 例如，NRAS和BRAF與癌癥相關(guān)，任何給定的癌細(xì)胞均可展示出NRAS和BRAF二者或 之一的突變。運(yùn)些突變與例如疾病的嚴(yán)重程度和/或?qū)μ囟ㄖ委熯x項(xiàng)的應(yīng)答相關(guān)。用于檢測(cè) 此類突變的傳統(tǒng)方法提供的多重性(multiplex)能力低于綜合臨床診斷所需的水平。多重 測(cè)定法的開(kāi)發(fā)可允許更快更經(jīng)濟(jì)地對(duì)患者進(jìn)行測(cè)試和篩查，使得健康護(hù)理得到改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本文所述的技術(shù)設(shè)及用于對(duì)NRAS和/或BRAF的突變(例如序列的改變)進(jìn)行檢測(cè)的 方法和測(cè)定法。發(fā)明人開(kāi)發(fā)了測(cè)定法并發(fā)現(xiàn)了方法，W在單個(gè)多重測(cè)定法中對(duì)NRAS和/或 BRAF的突變的存在或不存在進(jìn)行可靠測(cè)定。
[0009] -方面，本文描述了用于對(duì)NRAS和/或BRAF的突變進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法 包括:將核酸樣本的部分與引物組相接觸，其中，所述引物組包含引物對(duì)亞組，其中，各引物 對(duì)擴(kuò)增包含序列變異的NRAS或BRAF序列;對(duì)包含所述樣本的所述部分和一個(gè)或多個(gè)所述引 物組的反應(yīng)混合物實(shí)施PCR擴(kuò)增方案(regimen),所述擴(kuò)增方案包括鏈分離、引物退火和引 物延伸的循環(huán);檢測(cè)各引物對(duì)的擴(kuò)增子存在或不存在，其中，擴(kuò)增子的存在表明存在該引物 對(duì)對(duì)其具有特異性的序列變異，W及其中，所述引物中的一個(gè)或多個(gè)選自于由SEQ ID NO: 1-沈Q ID NO:39所組成的組。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，所述引物對(duì)選自于由如下引物對(duì)所組成的組:SEQ ID N0:1和 569 10側(cè)：8;569 10^:2和569 10側(cè)：8;569 10^:3和沈9 10側(cè)：8;569 10^:4和 569 10側(cè)：8;569 10^:5和569 10側(cè)：8;569 10^:6和沈9 10側(cè)：8;569 10^:7和 沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 10和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 11 和沈9 10側(cè)：14;569 10顯：12和沈9 10顯：14;569 10側(cè)：13和569 10顯：14;569 10 N0:15和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:19和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:20和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:33; SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :33; SEQ ID NO :23和沈Q ID NO :33; SEQ ID NO :24和SEQ ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :27和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :28和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:30和 沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:31 和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37;沈Q ID NO: 35和沈Q ID NO:38; W及沈Q ID NO: 36和沈Q ID NO:39。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)序 列變異為點(diǎn)突變。在一些實(shí)施方式中，NRAS點(diǎn)突變選自于由如下點(diǎn)突變所組成的組:G12D、 0125、6134、613(：、6130、6121?、613￥、961刖、9611(、96化、9611?1^及9611?2。在一些實(shí)施方式 中，BRAF點(diǎn)突變選自于由如下點(diǎn)突變所組成的組:V600D TG/AT、V600E T/A、V600E TG/AAW 及V600K GT/AA。在一些實(shí)施方式中，對(duì)存在或不存在G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、 613￥、961刖、96化、96化、961則^及9611?2進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，對(duì)存在或不存在 V600D TG/AT、V600E T/A、V600E TG/AAW及V600K GT/AA進(jìn)行檢測(cè)。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，所述核酸樣本由FFPE腫瘤樣本制備。在一些實(shí)施方式中，所述 樣本包含來(lái)自受試者的腫瘤細(xì)胞，所述受試者診斷患有選自于由如下病癥所組成的組中的 病癥：胃癌、腎癌、膽管瘤、肺癌、腦癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸部癌、肝細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、 黑色素瘤、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，一種或多種引物為雙結(jié)構(gòu)域引物。在一些實(shí)施方式中，來(lái)自引 物組的兩種W上引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物為可區(qū)分的。在一些實(shí)施方式中，借助有區(qū)別的大小 (distinct sizes)，將來(lái)自引物組的兩種W上引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)。在一些實(shí)施方式 中，通過(guò)用不同的可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，將來(lái)自引物組的兩種W上引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū) 分開(kāi)。在一些實(shí)施方式中，所述引物W約為實(shí)施例1的濃度存在于反應(yīng)混合物中。
[0013] -方面，本文描述了包含一個(gè)或多個(gè)引物對(duì)的組合物，所述引物對(duì)選自于由具有 如下序列的分子所組成的組：SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:8; SEQ ID NO: 2和沈Q ID N0:8; SEQ ID NO:3和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:4和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:5和SEQ ID NO:8; 沈Q ID NO:6和沈Q ID N0:8;SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14; SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:14;SEQ ID N0:11 和沈Q ID N0:14;SEQ ID N0:12和SEQ ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和沈Q ID N0:18;SEQ ID N0:19和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:20和 沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO: 23和沈Q ID NO :33;沈Q ID NO :24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO :28和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :29和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :30和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:31和沈Q ID NO:32; SEQ ID NO:：M和沈Q ID NO:37;SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38; W及沈Q ID NO:36和SEQ ID N0:39。在一些實(shí)施方式中，所述組合物可包含由具有如下序列的分子所組成的引物對(duì)： SEQ ID NO: 1 和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:2和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:3和SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:4和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:5和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:6和SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 14;沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 12和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 18;SEQ ID NO: 16和沈Q ID NO: 18; W及沈Q ID NO: 17 和SEQ ID NO: 18。在一些實(shí)施方式中，所述組合物可包含由具有如下序列的分子所組成的 引物對(duì)：SEQ ID N0:19和沈Q ID N0:33;SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:33;SEQ ID N0:21 和 沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:22和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 24和沈Q ID NO :33;沈Q ID NO :25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:28和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO :29和沈Q ID NO :32;沈Q ID N0:30和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:31 和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37; 沈Q ID N0:35和SEQ ID N0:38;W及沈Q ID N0:36和沈Q ID N0:39。在一些實(shí)施方式中，所 述引物對(duì)特異性地雜交至祀多核巧酸。在一些實(shí)施方式中，各引物對(duì)的至少一個(gè)成員為巧 光標(biāo)記的。
[0014] -方面，本文描述了包含巧光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物的組合物，所述巧光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn) 物由利用一個(gè)或多個(gè)引物對(duì)對(duì)祀多核巧酸進(jìn)行擴(kuò)增而獲得，所述一個(gè)或多個(gè)引物對(duì)選自于 由具有如下序列的分子所組成的組：SEQ ID NO: 1和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO: 2和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8;SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:8;SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:7和SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:14;沈Q ID N0:10和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:11 和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:12和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:16和 沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 20和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:28和沈Q ID NO:32; SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:32;SEQ ID N0:30和沈Q ID N0:32;SEQ ID N0:31 和SEQ ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37;SEQ ID N0:35和沈Q ID N0:38;W及沈Q ID N0:36 和沈Q ID NO:39。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，所述組合物可進(jìn)一步包含選自于由如下組分所組成的組中的 反應(yīng)混合物組分:緩沖液、dNTPW及DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中，所述組合物可進(jìn)一步包 含由FFPE腫瘤樣本制備的核酸樣本。在一些實(shí)施方式中，所述組合物可進(jìn)一步包含來(lái)自受 試者的腫瘤細(xì)胞，所述受試者診斷患有選自于由如下病癥所組成的組中的病癥：胃癌、腎 癌、膽管瘤、肺癌、腦癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸部癌、肝細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、間 皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述引物W約為實(shí)施例 1的濃度存在。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1描繪了根據(jù)實(shí)施例1所述的實(shí)施方式在ICEPlex系統(tǒng)上對(duì)NRAS/BRAF祀標(biāo)進(jìn)行 多重檢測(cè)的結(jié)果。上方子圖展示了在TYE通道檢測(cè)至Ij4種BRAF祀標(biāo)。下方子圖展示了在FAM通 道檢測(cè)到12種NRAS祀標(biāo)。
[0017] 圖2描繪了如實(shí)施例1所述對(duì)參照基因?qū)φ者M(jìn)行多重檢測(cè)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本文所述技術(shù)的實(shí)施方式設(shè)及用于對(duì)NRAS和/或BRAF的變異(例如序列（突變）、表 達(dá)水平和/或基因拷貝數(shù)的變異)進(jìn)行檢測(cè)的方法和測(cè)定法，特別是用于對(duì)NRAS和/或BRAF 的變異進(jìn)行檢測(cè)的多重和多模態(tài)(mu 11 imoda 1)測(cè)定法和方法。引物組和/或引物對(duì)亞組間 的干擾是多重PCR測(cè)定法中遇到的問(wèn)題。本文所述的方法和組合物至少在允許在單個(gè)反應(yīng) 中對(duì)多種不同的NRAS和/或BRAF突變(例如SNP)進(jìn)行高靈敏度的多重檢測(cè)且引物對(duì)之間無(wú) 顯著交叉反應(yīng)方面相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)做出了改進(jìn)。
[0019] 已知大量不同的NRAS和/或BRAF變異，由于變異的間隔較近，甚至在一些情況下重 疊，利用現(xiàn)有的單反應(yīng)技術(shù)對(duì)一個(gè)樣本中的此類變異組的存在和/或不存在進(jìn)行區(qū)分是存 在問(wèn)題的。必須將背景信號(hào)最小化，否則對(duì)于識(shí)別特定的突變而言測(cè)定法將不能可靠地工 作。
[0020] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"NRAS"或"神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS病毒癌基因同源物"指的是巧染色 體上編碼的小GlTase Ras家族蛋白。大量物種的NRAS序列為本領(lǐng)域所熟知，例如人NRAS (NCBI基因 10:4893;沈Q ID N0:40(NCBI Ref Seq:NM_002524;mRNA);沈Q ID N0:41(NCBI Ref Seq:NP_002515;多膚））。
[0021] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"BRAF"或"V-Raf鼠類肉瘤病毒癌基因同源物護(hù)指的是與AKTl相 互作用的Raf激酶家族絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶；CRaf、HRAS和YWHAB。大量物種的 BRAF序列為本領(lǐng)域所熟知，例如人BRAF(NCBI基因 ID:673;SEQ ID N0:42(NCBI Ref Seq: NM_004333;mRNA);沈Q ID N0:43(NCBI Ref Seq:NP_004324;多膚））。
[0022] -方面，本文描述了用于對(duì)NRAS和/或BRAF的突變進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)定法，所述測(cè)定法 包括:將核酸樣本的部分與引物組相接觸，其中，所述引物組包含引物對(duì)亞組，其中，各引物 對(duì)擴(kuò)增包含序列變異的NRAS或BRAF序列;對(duì)包含所述樣本的所述部分和一個(gè)或多個(gè)所述引 物組的反應(yīng)混合物實(shí)施PCR擴(kuò)增方案，所述擴(kuò)增方案包括鏈分離、引物退火和引物延伸的循 環(huán);檢測(cè)各引物對(duì)的擴(kuò)增子存在或不存在，其中，擴(kuò)增子的存在表明存在該引物對(duì)對(duì)其具有 特異性的序列變異。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，所述引物中的一個(gè)或多個(gè)選自于由具有序列SEQ ID NO: 1-SEQ ID N0:39的分子所組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述引物中的一個(gè)或多個(gè)選自于由 具有序列SEQ ID NO: I-SEQ ID NO: 18的分子所組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述引物中 的一個(gè)或多個(gè)選自于由具有序列SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:39的分子所組成的組。在一些 實(shí)施方式中，所述引物由具有序列SEQ ID NO: I-SEQ ID NO: 18的分子所組成。在一些實(shí)施 方式中，所述引物由具有序列SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:39的分子所組成。
[0024] NRAS和/或BRAF的變異可被用于診斷、預(yù)后和/或治療選擇中。在一些實(shí)施方式中， 在相同的反應(yīng)混合物中（例如在相同的管、孔或器皿中）對(duì)NRAS和/或BRAF的多個(gè)突變進(jìn)行 檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，本文所述的測(cè)定法在單管中實(shí)施，例如多個(gè)引物對(duì)亞組存在于單 個(gè)反應(yīng)混合物和/或器皿或容器中。因此，在所述實(shí)施方式中，單個(gè)擴(kuò)增方案將提供關(guān)于多 個(gè)突變存在和/或不存在的數(shù)據(jù)。
[0025] -方面，本文所述的方法和測(cè)定法設(shè)及對(duì)NRAS和/或BRAF中序列變異的存在進(jìn)行 檢測(cè)。本文使用的"序列變異"可W指替換、插入、缺失、重復(fù)或重排。在一些實(shí)施方式中，一 個(gè)或多個(gè)序列變異為點(diǎn)突變。
[0026] 序列變異(包括例如點(diǎn)突變、例如單核巧酸多態(tài)性(SNP))可W是表型上中性的，或 者可具有將其與該基因座處的優(yōu)勢(shì)(predominant)序列所表