一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及硫醇檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制備方 法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 巰基(-SH)在細(xì)胞中具有較高的化學(xué)活性。谷胱甘肽(L- y -谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，glutathione)是一種同時(shí)具有谷氨?；褪杌纳锘钚匀幕衔铩ＥR床上，谷 胱甘肽可以迅速提高機(jī)體免疫力，在抗氧化、抗輻射、清除自由基、解毒、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收等方 面具有良好的效果且無副作用。它在細(xì)胞內(nèi)氧化還原活動(dòng)，異生物質(zhì)的代謝，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳 導(dǎo)和基因調(diào)控等許多細(xì)胞功能中起到重要作用。谷胱甘肽對(duì)于放射線、放射性藥物所引起 的白細(xì)胞減少等癥狀，有強(qiáng)有力的保護(hù)作用。有許多疾病，如早期動(dòng)脈硬化、肺病、結(jié)腸癌、 白血病、阿爾海默癥和帕金森病患者等發(fā)病時(shí)，谷胱甘肽水平發(fā)生異常。對(duì)人體血漿、組織、 細(xì)胞中谷胱甘肽含量的測(cè)定和研究，可以提供關(guān)于細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)及反應(yīng)狀態(tài)的信 息。含硫醇的物質(zhì)在生物系統(tǒng)中的水平的評(píng)估可以有助于某些疾病的早期診斷。
[0003] 熒光分子成像技術(shù)是近年發(fā)展迅速的一種新興的分子成像技術(shù)，它利用具有特異 性的熒光分子探針標(biāo)記特定的分子或細(xì)胞，從分子和細(xì)胞水平上對(duì)正?；虍惓５纳镞^程 進(jìn)行空間和時(shí)間上的視覺描述，是一種非侵入式的成像方式。熒光探針具有高的熒光量子 產(chǎn)率、長的分析波長、良好的生物兼容性、穩(wěn)定性、選擇性、靈敏度，以及動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬等 諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其是熒光法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)活體的靈敏、原位、實(shí)時(shí)成像，近年來在生物化學(xué)、細(xì)胞 生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、分子生物學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，成為目前廣泛采用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) 硫醇類物質(zhì)的一種重要手段。香豆素類熒光團(tuán)分子摩爾吸光系數(shù)較大，熒光量子產(chǎn)率較高， 因此香豆素類染料常被用作為發(fā)色基團(tuán)來合成高效的熒光探針。香豆素分子易于衍生和修 飾，而且激發(fā)波長在可見區(qū)，這些特點(diǎn)使其成為了熒光探針設(shè)計(jì)和合成中優(yōu)秀的候選熒光 團(tuán)。
[0004] 目前測(cè)定硫醇化合物含量的方法有多種，如高效毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法、熒光分 析法和近些年發(fā)展的高效液相色譜法等。目前對(duì)于谷胱甘肽的測(cè)定還沒建立一個(gè)既十分靈 敏、特異，又十分快速、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的方法。硫醇化合物的各種測(cè)定方法各有其優(yōu)點(diǎn)，有的靈 敏度高，有的快速可靠，有的可區(qū)分開各種成分；同時(shí)避免不了一些問題出現(xiàn)，例如有的制 備工藝較為復(fù)雜，有的對(duì)硫醇化合物中的各種成分的測(cè)定區(qū)分不開，有的實(shí)驗(yàn)條件較為苛 刻等。因此，方便廉價(jià)、能夠定性定量分析生物硫醇，并且可以對(duì)生物樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的 方法非常重要。如同熒光分析法在檢測(cè)金屬離子獲得廣泛應(yīng)用一樣，在眾多檢測(cè)生物硫醇 的方法中，熒光分析法具有操作簡便、直觀等優(yōu)點(diǎn)，適于巰基物質(zhì)成像分析，因而引起了人 們的廣泛關(guān)注。該方法反應(yīng)速度快，硫醇化合物和熒光物質(zhì)通常在室溫下即可測(cè)定，靈敏度 較高，有一定的穩(wěn)定性，一些熒光加合反應(yīng)有一定的專一性。因此，設(shè)計(jì)合成熒光探針以檢 測(cè)谷胱甘肽等小分子生物硫醇具有重要的意義。
[0005] 目前檢測(cè)硫醇的探針多為檢測(cè)硫醇化合物的總量，例如利用硫醇化合物中的巰基 的未核性檢測(cè)硫醇的焚光探針，利用疏基和^硫鍵的氧化還原反應(yīng)檢測(cè)硫醇的焚光探針， 利用巰基與金屬離子絡(luò)合能力檢測(cè)硫醇的熒光探針，該類硫醇熒光探針設(shè)計(jì)容易，但是很 難把半胱氨酸、同型半胱氨酸和還原型谷胱甘肽進(jìn)行區(qū)分。而利用醛基、氨基和巰基的共同 作用檢測(cè)硫醇化合物，則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)某一種硫醇分子特異性的識(shí)別，例如半胱氨酸或同型 半胱氨酸的共輒加成環(huán)化反應(yīng)、半胱氨酸或同型半胱氨酸的醛成環(huán)反應(yīng)、半胱氨酸與醛基 縮合再與雙鍵加成成環(huán)反應(yīng)、半胱氨酸發(fā)生分子內(nèi)親核取代反應(yīng)、親核取代-加成成環(huán)反應(yīng) 等，但這類探針設(shè)計(jì)較為困難，因此設(shè)計(jì)合成更多可以針對(duì)生物體內(nèi)不同種類硫醇分子分 析檢測(cè)的特異性熒光分子探針更加重要。
[0006] 近年來檢測(cè)巰基物質(zhì)的光學(xué)探針的研究發(fā)展極為迅速，所報(bào)道的探針在生理?xiàng)l件 下大多有著較好的分析性能，且探針信號(hào)變化受環(huán)境因素(如pH值、溫度和極性等）的影響 較小，從而為生物樣品中巰基物質(zhì)的測(cè)定和細(xì)胞成像研究提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制 備方法及應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針的制備方法，以香豆酰 肼和對(duì)叔丁基苯酚二醛為原料合成了一種席夫堿結(jié)構(gòu)的香豆素類衍生物，其在與銅離子絡(luò) 合后制成了席夫堿結(jié)構(gòu)的香豆素類一銅離子（n)配合物硫醇熒光探針。
[0009] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：
[0010] 將0 ? 3028g的香豆酰肼（1 ? lmmol，MW= 275 ? 3031 )溶于最少量的乙醇中，加入 0.1031g的對(duì)叔丁基苯酚二醛(0.5mmol，MW= 206.2378);氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱回流12小時(shí)，點(diǎn) 板監(jiān)測(cè)反應(yīng)，冷卻后有沉淀析出，所得沉淀抽濾，并用乙醇洗滌數(shù)次，即得對(duì)叔丁基苯酚二 醛香豆酰肼，即化合物I。
[0011] 將5.1374g的對(duì)叔丁基苯酚(34.2mmol，MW= 150.2176)和9.6028g的六次甲基四胺 (68.5111111〇1爲(wèi)=140.1863)溶于6〇1^的三氟乙酸溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流2411，冷卻到室溫， 倒入4mol/L的HC1溶液中，攪拌30min，用100mL CH2C12萃取2次，有機(jī)相加水調(diào)pH至中性，再 用100mL CH2C12萃取2次，用200mL水洗滌;無水Na2S〇4干燥，旋蒸得到黃色油狀液體，粗產(chǎn)品 用硅膠色譜柱提純，得淺黃色固體即對(duì)叔丁基苯酚二醛。
[0012] 7 ? 7297g的4-二乙基氨基水楊醛（0 ? 04mol，MW= 193 ? 2423)，12 ? 8134g的丙二酸二 乙酯(0.08mo 1，MW=160.1678)和4mL哌啶在120mL無水乙醇中混和，混合液在攪拌條件下回 流6小時(shí)，冷卻到室溫，旋蒸至乙醇溶劑不再蒸出，得到少量油狀液體即為7-N，N-二甲基氨 基-2-氧-2H-3-香豆酸酯。將4.3399g的7-N，N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸酯（15mmol， M w=289.3264)溶于40毫升乙醇中，加入3.64mL的80%水合肼（60mmol)，室溫?cái)嚢?2分鐘 后，冰水中冷卻15分鐘。所得沉淀抽濾，粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱提純，即得產(chǎn)物香豆酰肼。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針，按照上述的方 法制得。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針在谷胱甘肽檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種基于香豆酰肼的硫醇熒光探針在硫醇化合物檢測(cè)中的 應(yīng)用。
[0016]化合物i本身具有較強(qiáng)熒光，而探針i-cu( n)為弱熒光化合物，隨著硫醇化合物的 加入，硫醇基團(tuán)的脫金屬作用使探針I(yè)-Cu( n)釋放出化合物I，這樣就與探針I(yè)-Cu( n)產(chǎn)生 了很大的熒光變化，從而達(dá)到檢測(cè)硫醇化合物的目的。
[0017] 本發(fā)明以香豆酰肼和對(duì)叔丁基苯酚二醛為原料合成了一種雙席夫堿香豆素類衍 生物(化合物I)，化合物I本身具有較強(qiáng)的熒光，在與銅離子配位后制成了席夫堿結(jié)構(gòu)的香 豆素類一銅離子（n)配合物，即為硫醇熒光探針i-cu( n)。該探針由于cu2+的順磁性及光誘 導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用的影響，使化合物I的熒光淬滅。而巰基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽等化 合物中的硫原子與cu 2+具有更強(qiáng)的配位作用，這種競(jìng)爭(zhēng)配位作用導(dǎo)致香豆素一銅離子（n) 配合物中的銅離子被巰基氨基酸及其衍生物奪走，重新生成化合物I，從而恢復(fù)化合物I的 熒光。基于此本發(fā)明建立了一種快速、簡便的檢測(cè)硫醇化合物的方法。
[0018] 探針I(yè)-Cu ( n )在CH3CN: H20(3:2，v/v)溶液中對(duì)含有巰基的氨基酸具有良好的選擇 性，其他非巰基氨基酸對(duì)探針i-cu(n)的熒光影響很小，共存時(shí)也不會(huì)干擾谷胱甘肽對(duì)探 針I(yè)-Cu(n)的增強(qiáng)響應(yīng)，并成功用于人子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa細(xì)胞中進(jìn)行了檢測(cè)谷胱甘肽的 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。
[0019] 巰基氨基酸對(duì)銅離子(Cu2+)的高親和能力促使配合物脫銅可能是其實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng) 識(shí)別的機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)了該探針對(duì)含巰基氨基酸及其衍生物如谷胱甘肽的檢測(cè)，是一種選 擇性好、抗干擾能力強(qiáng)的硫醇熒光探針。此外，探針具有細(xì)胞膜滲透性和低細(xì)胞毒性，還具 有良好的光化學(xué)穩(wěn)定性。因此，該探針適用于檢測(cè)在活細(xì)胞中硫醇化合物的水平，